人類(lèi)唾液成分復(fù)雜，主要成分是水（約占99%），其次富含DNA、RNA、蛋白質(zhì)、微生物及代謝產(chǎn)物等。與血液相似，唾液中同樣蘊(yùn)含大量能反映全身健康狀況的生物信息，且唾液收集具有簡(jiǎn)單無(wú)創(chuàng)、攜帶安全、儲(chǔ)存運(yùn)輸成本低等優(yōu)勢(shì)，因此，唾液可望作為理想的血液替代品用于疾病的篩查。隨著生命科學(xué)研究的不斷發(fā)展，微陣列技術(shù)和全基因組測(cè)序、全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等高通量、高敏感性技術(shù)已廣泛用于唾液生物標(biāo)志物的研究。
唾液組學(xué)在快速獲得和篩選生物標(biāo)志物、臨床診斷治療疾病及療效監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮著極其重要的作用，主要涵蓋唾液基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、微生物組學(xué)、代謝組學(xué)等領(lǐng)域。近年來(lái)，以唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展最為迅速，微生物組學(xué)和代謝組學(xué)研究也方興未艾?，F(xiàn)就唾液組學(xué)研究進(jìn)展及唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)在口腔癌中的臨床應(yīng)用價(jià)值作一闡述。
1.唾液組學(xué)與口腔癌
唾液基因組主要包含人類(lèi)DNA，來(lái)自口腔粘膜細(xì)胞，約占70%，此外還有口腔微生物和病毒DNA。Abraham和Looi等將唾液DNA和血漿DNA進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)唾液DNA在260nm和280nm下吸光度比值為1.56，純度與血漿DNA相近，且性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，基因分型與血漿高度一致。盡管唾液中DNA含量（約為12μg/mL）不足血漿DNA的50%（約為26μg/mL），但已足夠用于基因分型、DNA測(cè)序及PCR等檢測(cè)。學(xué)者前期研究發(fā)現(xiàn)血漿游離循環(huán)腫瘤DNA（cell-freecirculatingtumorDNA，ctDNA）的基因突變圖譜、啟動(dòng)子甲基化水平變化、微衛(wèi)星變化等與原發(fā)腫瘤高度一致，被認(rèn)為是極有潛力的腫瘤早期篩查與療效評(píng)估手段。
近年來(lái)，唾液中DNA表達(dá)譜變化也被報(bào)道與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Liao等報(bào)道，62.5%的口腔癌患者唾液DNA中p53基因4號(hào)外顯子第63位密碼子發(fā)生突變，p53基因是關(guān)鍵的抑癌基因，大約50%的惡性腫瘤與p53基因的突變相關(guān)。Carvalho等分析了61例頭頸癌患者唾液中TIMP3、MGMT、MINT31、CyA1、DCC、DAPK和p16等抑癌基因甲基化水平，發(fā)現(xiàn)54.1%的標(biāo)本出現(xiàn)了至少一個(gè)基因啟動(dòng)子甲基化。蛋白質(zhì)組學(xué)從整體角度分析細(xì)胞、組織及生物體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，以揭示蛋白質(zhì)功能及相互作用規(guī)律。唾液中共鑒定出1166種蛋白質(zhì)，其中914種由腮腺分泌，917種來(lái)自頜下腺和舌下腺，約有57%的蛋白由3個(gè)腺體共同分泌。
唾液蛋白質(zhì)含量約為0.5～3g/L，僅相當(dāng)于血液中的30%左右，但其表達(dá)水平的變化仍可在很大程度上反映疾病狀態(tài)，在疾病篩查、療效評(píng)估上發(fā)揮極其重要的作用。比如在口腔癌患者唾液中已發(fā)現(xiàn)MMP-1、MMP-3和MMP-9等蛋白酶和IL-1α、IL-6、VEGF-A、TNF-α和IL-1RA等細(xì)胞因子表達(dá)顯著上調(diào)，其中IL-1RA和TNF-α已被證實(shí)在低分化鱗癌患者唾液中上調(diào)更為顯著，可作為評(píng)判預(yù)后的指標(biāo)。
近年來(lái)，高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜對(duì)唾液蛋白組分進(jìn)行分析，可大大提高蛋白質(zhì)的鑒定效能。Sivadasan等使用液相色譜聯(lián)串質(zhì)譜技術(shù)，從口腔癌患者唾液中篩選出292種潛在的生物標(biāo)志物，分析效能明顯高于傳統(tǒng)技術(shù)。唾液代謝組學(xué)主要對(duì)唾液中相對(duì)分子質(zhì)量小于1000的中間代謝產(chǎn)物、激素、其他信號(hào)分子及二級(jí)代謝產(chǎn)物等進(jìn)行定性和定量分析，以弄清疾病特征性代謝產(chǎn)物，了解其發(fā)生原因及代謝途徑，在腫瘤及口腔感染性疾病的評(píng)估上均具有一定潛力。
Sugimoto等利用毛細(xì)管電泳飛行時(shí)間質(zhì)譜分析法對(duì)口腔癌、乳腺癌、胰腺癌患者和健康對(duì)照組的唾液代謝組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)唾液中存在眾多反映疾病代謝水平的特異性產(chǎn)物?？谇话┗颊咄僖褐需b定出包括吡咯啉、膽堿和纈氨酸在內(nèi)的28種與對(duì)照組存在差異的代謝產(chǎn)物，受試者工作特征曲線(xiàn)下面積為0.865，具有一定的可靠性。近期研究發(fā)現(xiàn)，98種代謝產(chǎn)物在口腔癌患者唾液中水平高于對(duì)照組，以S-腺苷甲硫氨酸和甲基哌啶差異最為顯著，可望用于口腔癌診斷。
微生物組學(xué)主要通過(guò)DNA雜交、16SrRNA測(cè)序和宏基因組測(cè)序等技術(shù)對(duì)樣本中所有微生物種類(lèi)、豐度以及微生物群體代謝潛能進(jìn)行評(píng)估，從宏觀角度觀察微生物群落與疾病之間的關(guān)系。曾有學(xué)者采用DNA雜交技術(shù)檢測(cè)了口腔癌患者唾液中40種常見(jiàn)細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌、產(chǎn)黑色素普氏菌和輕鏈球菌水平顯著上調(diào)，對(duì)口腔癌的早期篩查有一定幫助。
2.唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)與口腔癌標(biāo)志物
轉(zhuǎn)錄組學(xué)在整體水平上研究某細(xì)胞在某時(shí)刻的全部基因轉(zhuǎn)錄本種類(lèi)、結(jié)構(gòu)和功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律。狹義轉(zhuǎn)錄組指可翻譯蛋白質(zhì)的mRNA總和，廣義轉(zhuǎn)錄組指從一種組織或基因組轉(zhuǎn)錄的RNA總和，包括編碼蛋白質(zhì)的mRNA和各種非編碼RNA（包括rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、miRNA等）。研究技術(shù)主要有基于分子雜交技術(shù)的微陣列技術(shù)和基于測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，包括表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)、基因表達(dá)系列分析技術(shù)、大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)以及RNA測(cè)序技術(shù)。
在腫瘤分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析惡性腫瘤的轉(zhuǎn)錄組信息，認(rèn)識(shí)惡性腫瘤的基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律，構(gòu)建分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，已成為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的前沿?zé)狳c(diǎn)。比如在胰腺癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤患者的血液、尿液、組織標(biāo)本中均已發(fā)現(xiàn)各自的特異性RNA標(biāo)志物。迄今為止，唾液中已檢測(cè)出多于3000種mRNA和300種miRNA，另外還有一些不參與編碼蛋白的RNA分子，如piRNA、circRNA、LncRNA等，唾液中豐度比血清和腦脊液高，且性質(zhì)穩(wěn)定，能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定存在于唾液中，正吸引眾多學(xué)者在轉(zhuǎn)錄組水平研究疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。
2.1 唾液mRNA與口腔癌標(biāo)志物
mRNA性質(zhì)極不穩(wěn)定，可能在數(shù)分鐘內(nèi)完全降解，早先認(rèn)為mRNA無(wú)法穩(wěn)定存在于離體組織、血液、唾液等標(biāo)本中。隨著檢測(cè)手段不斷完善，組織、血液中的mRNA相繼被成功提取和鑒定，唾液中mRNA的分離鑒定也備受關(guān)注。Li等于2004年首次在唾液中檢測(cè)到穩(wěn)定的mRNA，可用于PCR、微陣列、高通量測(cè)序等檢測(cè)；進(jìn)一步收集32例T1/T2期口腔癌患者和32例正常人非刺激性唾液，利用人類(lèi)全基因組表達(dá)譜芯片u133A對(duì)唾液上清轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，篩選出1679個(gè)差異表達(dá)的基因轉(zhuǎn)錄本；經(jīng)qPCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)IL-8高度上調(diào)，H3F3A、IL-1β和S100P中度上調(diào)，DUSP1、OAZ1和SAT低度上調(diào)，IL-1β、OAZ1、SAT1、IL-8組合用于診斷口腔癌的靈敏度和特異度均達(dá)0.91。
另外，將轉(zhuǎn)錄組和蛋白標(biāo)志物結(jié)合也可較大程度提高口腔癌診斷效能。Brinkmann等報(bào)道L1B蛋白+SAT1mRNA+DUSP1mRNA用于診斷口腔癌的靈敏度和特異度分別為89%和78%，IL-1βmRNA+SAT1mRNA+DUSP1mRNA可用于口腔癌早期篩查，IL-1β蛋白+DUSP1mRNA可作為晚期口腔癌評(píng)判指標(biāo)。
2.2 唾液microRNA與口腔癌標(biāo)志物
微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度為19～24個(gè)核苷酸的高度保守的非編碼單鏈RNA，一個(gè)miRNA可靶向調(diào)控多個(gè)mRNA，通過(guò)完全或不完全結(jié)合靶基因mRNA的3’區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制或阻斷靶基因表達(dá)。與DNA和mRNA相比，miRNA具有更強(qiáng)的時(shí)間和空間特異性，可更精確地反映疾病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。miRNA與腫瘤關(guān)系的研究起始于2002年，Calin等報(bào)道慢性粒細(xì)胞性白血病患者miR-15和miR-16缺失或下調(diào)，進(jìn)一步研究證實(shí)miR-15/miR-16能負(fù)向調(diào)控癌基因Bcl-2表達(dá)，該發(fā)現(xiàn)使miRNA作為潛在的腫瘤標(biāo)志物受到空前廣泛的關(guān)注。
在隨后10來(lái)年中，已有大量腫瘤特異性miRNA被篩選和鑒定，例如，miR-21、miR-155等已被證實(shí)在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，是研究最廣泛的促癌miRNAs。又如let-7家族、miR-145等，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌等組織中表達(dá)顯著下調(diào)，是目前研究最為透徹的抑癌miR-NA。然而由于miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜，樣本例數(shù)不同及樣本個(gè)體差異，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化操作流程等原因，導(dǎo)致該領(lǐng)域研究可重復(fù)性不理想，不同研究者往往很難得到一致的結(jié)果，其可靠性也有待驗(yàn)證。近年來(lái)，唾液miRNA因性質(zhì)穩(wěn)定、取材方便而備受關(guān)注。
Park等通過(guò)檢測(cè)12例口腔癌患者和12例健康對(duì)照組唾液中300多個(gè)miRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-200a、miR-125a、miR-142-3p、miR-93在兩組間差異表達(dá)。qPCR檢測(cè)證實(shí)在口腔癌患者唾液中僅有miR-125a和miR-200a顯著下調(diào)，ROC曲線(xiàn)下面積分別為0.65和0.62，敏感性及特異性均不理想。Wiklund等也做了類(lèi)似研究，并未證實(shí)miR-200a表達(dá)量與對(duì)照組存在顯著差異，卻發(fā)現(xiàn)miR-375在口腔癌患者唾液中下調(diào)顯著，可用于口腔癌的早期篩查。
在不同的腫瘤中，miRNA可能因?yàn)榘邢虿煌哪康幕蚨l(fā)揮不同甚至相反的作用，充分體現(xiàn)了miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性和研究的挑戰(zhàn)性。近年來(lái)，有大量文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-31在胃癌、膀胱癌、胰腺癌和黑色素瘤等惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，其可能通過(guò)抑制RhoA、Fzd3、ITGA5、M-RIP、MMP16、RDX等轉(zhuǎn)移促進(jìn)基因表達(dá)，抑制腫瘤進(jìn)展。有趣的是，Liu等卻發(fā)現(xiàn)在口腔癌發(fā)展的各個(gè)階段，腫瘤組織、血漿和唾液miR-31均呈過(guò)表達(dá)，其表達(dá)量隨腫瘤的切除而顯著下調(diào)，在口腔癌中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用，且唾液miR-31豐度較血漿高，用于口腔癌的篩查和療效評(píng)估具有更高的敏感性。白斑、紅斑、扁平苔蘚等口腔潛在惡性病變（oralpotentialmalignantdisorders，OPMD）具有一定癌變潛能，且癌變發(fā)生在口腔癌進(jìn)展的早期，因此，尋找反映OPMD癌變風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物對(duì)口腔癌的早期篩查具有重要意義。
Zahran等通過(guò)分析OPMD、口腔鱗狀細(xì)胞癌（oralsquamouscellcarcino-ma，OSCC）、復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者和正常對(duì)照組唾液miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)OSCC組和OPMD組miR-NA-21和miRNA-184表達(dá)顯著上調(diào)，miRNA-145顯著下調(diào)，建議將miR-21上調(diào)4倍、miR-184上調(diào)3倍和miR-145下調(diào)0.6作為評(píng)判OPMD癌變的標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)學(xué)者分析了癌變白斑患者唾液miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與未癌變白斑患者相比，唾液miR-429過(guò)表達(dá)，miR-181、miR-144、miR-521、miR-339低表達(dá)，因未做敏感性及特異性分析，以上指標(biāo)能否幫助口腔癌早期診斷仍有待驗(yàn)證。此外，唾液中還有一些miRNA表達(dá)水平變化被報(bào)道與口腔癌有關(guān)。
Momen-Heravi等報(bào)道，miRNA-136和miR-27b在口腔癌患者唾液中呈低表達(dá)，用于口腔癌診斷的特異性達(dá)100%，靈敏度也高于85%。Salazar等發(fā)現(xiàn)口腔癌患者唾液miR-191、miR-9表達(dá)顯著上調(diào)，miR-134顯著下調(diào)，以上結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)腫瘤組織測(cè)序結(jié)果高度一致，其中miR-9和miR-134的ROC曲線(xiàn)下面積分別為0.85和0.98，有望成為頭頸癌早期診斷的唾液標(biāo)志物。盡管現(xiàn)階段唾液miRNA與腫瘤關(guān)系的研究相對(duì)成熟，但仍需對(duì)現(xiàn)有標(biāo)志物的靈敏度及特異度進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)室到臨床的轉(zhuǎn)化。
2.3 唾液LncRNA與口腔癌標(biāo)志物
長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Longnone-codingRNA，ln-cRNA）是一類(lèi)位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，具有時(shí)間與空間特異性，可在多層面（表觀遺傳學(xué)、選擇性剪接和調(diào)控mRNA降解等）調(diào)控基因的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。LncRNA在起初被認(rèn)為在基因表達(dá)過(guò)程中不發(fā)揮任何生物學(xué)功能而未受到足夠重視。
2007年，Rinn等對(duì)LncRNAHOTAIR（HOXtranscriptantisenseRNA）的功能進(jìn)行了詳細(xì)解讀，認(rèn)為其在基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)中發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用，至此，Ln-cRNA才作為一個(gè)新興領(lǐng)域開(kāi)始受到學(xué)者關(guān)注。芯片技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)的推廣極大程度推動(dòng)了LncRNA研究進(jìn)展，近幾年更是爆發(fā)了該領(lǐng)域研究熱潮，大量LncRNA的鑒定和功能解析幫助人們從基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的角度進(jìn)一步認(rèn)識(shí)復(fù)雜的生命過(guò)程。
美國(guó)斯坦福大學(xué)的研究人員在2012年通過(guò)高通量RNA-seq技術(shù)完成了首個(gè)大型惡性腫瘤相關(guān)LncRNA表達(dá)譜分析，在64個(gè)惡性腫瘤類(lèi)型之間找到1065個(gè)差異表達(dá)的LncRNA。隨后，學(xué)者又在血液、尿液和唾液等標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了多種腫瘤特異性LncRNA。唾液LncRNA與口腔癌關(guān)系的研究仍處于初期階段，尚無(wú)突破性的研究成果，對(duì)其調(diào)控機(jī)制也未進(jìn)行深入的探討，目前相關(guān)領(lǐng)域僅檢索到一篇文獻(xiàn)。Tang等選擇了6個(gè)已證實(shí)與腫瘤密切相關(guān)的LncRNA（MALAT-1、HULC、HOTAIR、NEAT-1、MEG-3和UCA1）為目標(biāo)分子，通過(guò)分析9位口腔癌患者腫瘤組織、癌旁組織和唾液中目標(biāo)LncRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)口腔癌患者腫瘤組織HOTAIR、NRAT-1和UCA1表達(dá)上調(diào)，MEG-3下調(diào)，上述變化在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中更為顯著。
唾液檢測(cè)僅有5位患者唾液MALAT-1上調(diào)，其中3位伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。提示MALAT-1在一定程度上反映口腔癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，但唾液MALAT-1能否作為判斷口腔癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、評(píng)估預(yù)后的指標(biāo)仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是后基因組時(shí)代率先發(fā)展起來(lái)且應(yīng)用最廣的學(xué)科，是連接基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的“紐帶”。唾液轉(zhuǎn)錄組學(xué)在近年來(lái)迅速崛起，在RNA芯片和RNA測(cè)序等高通量技術(shù)支持下，已有大量口腔癌相關(guān)唾液RNA標(biāo)志物被篩選和鑒定。但該領(lǐng)域研究尚處于早期階段，仍面臨諸多問(wèn)題與挑戰(zhàn)，如缺乏唾液樣本采集、處理及保存的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，標(biāo)志物敏感性及特異性有待驗(yàn)證，LncRNA、circRNA等最新RNA領(lǐng)域研究相對(duì)空白，尚無(wú)可單獨(dú)用于口腔癌診斷的唾液指標(biāo)等。因此，未來(lái)應(yīng)以LncRNA為突破口，完善操作規(guī)程，挖掘更多高靈敏度和特異性的唾液標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)口腔癌早期診斷、評(píng)估和治療。
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