Global metabolic profiling identifies a pivotal role of proline and hydroxyproline metabolism in supporting hypoxic response in hepatocellular carcinoma
全代謝輪廓分析確定脯氨酸及羥脯氨酸代謝在支持肝細(xì)胞癌缺氧反應(yīng)中的關(guān)鍵作用
期刊：Clinical Cancer Research IF：10.199
發(fā)表日期：2017.10
研究背景
代謝重編程是癌細(xì)胞的標(biāo)志，也是研究人員感興趣的永恒主題。癌細(xì)胞重新編程其細(xì)胞代謝，消耗更多的能量和材料，用于增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。盡管不同腫瘤類型具有這些共同特征，但許多內(nèi)在遺傳損傷和外在非遺傳影響也可能以腫瘤依賴性方式促成代謝異常。 為了提高癌癥患者的存活率，更好地理解與特定惡性腫瘤相關(guān)的失調(diào)代謝是非常有必要的，以便為早期臨床診斷和潛在的治療干預(yù)提供有希望的機(jī)會。
在之前的研究中，肝細(xì)胞癌（HCC）腫瘤代謝的改變包括上調(diào)的糖酵解、糖異生和β-氧化以及下調(diào)的三羧酸循環(huán)。然而，氨基酸代謝在HCC發(fā)病機(jī)制中的作用尚未確定。致癌基因MYC可通過調(diào)節(jié)該途徑中的酶促進(jìn)谷氨酰胺/脯氨酸代謝，提示脯氨酸代謝參與腫瘤的發(fā)生。
實驗設(shè)計
采用CE-TOF/MS對69對肝癌及鄰近組織標(biāo)本進(jìn)行非靶向代謝組研究，對主要研究結(jié)果進(jìn)行靶向代謝組學(xué)方法驗證，同時結(jié)合生物學(xué)研究，探討脯氨酸生物合成在肝癌發(fā)病機(jī)制中的作用。
研究結(jié)果
代謝組廣篩尋找關(guān)鍵差異代謝物
根據(jù)PLS-DA分析結(jié)果，肝癌組與（癌旁組織及正常組織）直接在代謝輪廓上有明顯區(qū)分，而癌旁組織和正常組織之間也存在明顯差異。結(jié)合多元統(tǒng)計分析VIP＞1及單元統(tǒng)計分析p＜0.05、FDR＜0.05，與腫瘤有關(guān)的差異代謝物共篩選到13個。經(jīng)通路分析發(fā)現(xiàn)，與同類物質(zhì)相比，僅羥脯氨酸呈現(xiàn)獨(dú)特的變化規(guī)律：從正常組織、癌旁組織、癌組織，含量遞增。
2. 關(guān)鍵差異代謝物的靶向驗證
對發(fā)現(xiàn)集（69例樣本）中的18對癌組織與癌旁組織進(jìn)行靶向內(nèi)部驗證（圖B），同時用來自另一臨床中心的外部驗證集的33對樣本進(jìn)行靶向外部驗證（圖C），發(fā)現(xiàn)羥脯氨酸變化趨勢與廣篩結(jié)果相符合。
3. 羥脯氨酸與HCC發(fā)病機(jī)制間的相關(guān)性
通過對臨床肝癌生物標(biāo)志物AFP的檢測發(fā)現(xiàn)，低含量AFP組呈現(xiàn)更低的羥脯氨酸含量，同時表現(xiàn)為更好的預(yù)后效果。即羥脯氨酸在肝癌的疾病進(jìn)展中可能發(fā)揮著重要作用。
4. 羥脯氨酸積累的體外生物學(xué)功能驗證
細(xì)胞侵襲能力評估表明，在低氧環(huán)境下，外界加入羥脯氨酸時，細(xì)胞的運(yùn)動性及侵襲能力變強(qiáng)，而低氧誘導(dǎo)因子（HIF1α）含量增加。反之，當(dāng)敲除HIF1α?xí)r，細(xì)胞活性會受到明顯抑制。從而生成假設(shè)：羥脯氨酸是否是通過調(diào)節(jié)HIF1α依賴型表型來影響腫瘤的發(fā)展。
5. 羥脯氨酸積累的體外生物學(xué)功能驗證
SMMC-7221細(xì)胞皮下注射小鼠（2組，每組5只生物學(xué)重復(fù)），一組為陰性對照組，另一組用羥脯氨酸處理。結(jié)果表明，3周后，羥脯氨酸組的腫瘤體積約為對照組的2倍，HIF1α水平上調(diào)，且Ki67免疫反應(yīng)活性增加，揭示了羥脯氨酸在HCC機(jī)制中的促增殖作用。除此之外，免疫組化結(jié)果也顯示，羥脯氨酸組的CD31水平上調(diào)，即腫瘤血管生成增加。因此，羥脯氨酸可通過調(diào)節(jié)HIF1α依賴型表型來影響腫瘤的發(fā)展。
6. 體外驗證（分子生物學(xué)手段）——羥脯氨酸積累調(diào)控生物學(xué)行為的分子機(jī)制
細(xì)胞實驗結(jié)果表明，在低氧條件下，隨時間增加，ALDH18A1（合成脯氨酸的關(guān)鍵酶）、PRODH（生成羥脯氨酸）的表達(dá)上調(diào)，而PRODH2（分解羥脯氨酸）的表達(dá)下調(diào)，與細(xì)胞中羥脯氨酸含量升高、HIF1α及MMP9表達(dá)上調(diào)的結(jié)論相符。
為確定是否低氧條件會促進(jìn)肝癌細(xì)胞中脯氨酸產(chǎn)物的積累，用13C標(biāo)記的谷氨酰胺處理細(xì)胞，同位素示蹤實驗表明，低氧會增加肝癌細(xì)胞中的谷氨酸及脯氨酸水平。
已有文獻(xiàn)報道表明，HCC中致癌基因MYC通常處于被激活的狀態(tài)，且通過調(diào)節(jié)谷氨酰胺酶（GLS）來控制谷氨酰胺的分解，于是作者假設(shè)MYC是通過影響谷氨酰胺的分解來調(diào)控低氧條件下脯氨酸的積累，為此再次進(jìn)行細(xì)胞驗證實驗，敲除掉HCC細(xì)胞中的MYC基因，結(jié)果顯示在3h內(nèi)（低氧條件），谷氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的含量均降低，與ALDH18A1、MYC的變化呈正相關(guān)，但并不影響脯肽酶（PLD，它催化含有C-末端脯氨酸或羥脯氨酸2肽的水解，對膠原合成和細(xì)胞生長過程中脯氨酸的再循環(huán)起重要作用）的表達(dá)。
細(xì)胞內(nèi)的羥脯氨酸只能來源于脯氨酸，脯氨酸被PHs（脯氨酸羥化酶）羥基化。在這種情況下，脯氨酸和羥脯氨酸可以通過PLD從原膠原中釋放出來。當(dāng)PLD被抑制時，低氧條件下HIF1α的表達(dá)被抑制，若額外添加羥脯氨酸，HIF1α的表達(dá)則顯著增加。而隨著羥脯氨酸的增加，羥化HIF1α呈現(xiàn)劑量依賴式抑制，HIF1α表達(dá)量增加。
為了確定在MYC缺失時，外源性羥脯氨酸是否也具有穩(wěn)定HIF1α的作用，對細(xì)胞中的MYC基因進(jìn)行了敲除，當(dāng)同時敲除掉ALDH18A1或是實行谷氨酰胺饑餓時，可顯著降低HCC細(xì)胞的活性，而當(dāng)外源添加羥脯氨酸時，HIF1α的表達(dá)及HCC細(xì)胞的活性均得到有效恢復(fù)。因此，谷氨酰胺-脯氨酸的轉(zhuǎn)換對于調(diào)節(jié)HIF1α響應(yīng)低氧至關(guān)重要。
7. 尋找新的藥物靶點——低氧條件下脯氨酸代謝影響HCC細(xì)胞存活及索拉菲尼耐藥性
索拉菲尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，應(yīng)用于臨床晚期肝癌的治療。在對細(xì)胞進(jìn)行ALDH18A1進(jìn)行敲除后，在低氧條件下，使用索拉菲尼處理細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脯氨酸的合成被抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并提高HCC細(xì)胞對索拉菲尼的敏感度。也就是說，谷氨酰胺、脯氨酸和羥脯氨酸代謝軸通過調(diào)節(jié)HCC中的HIF1α來促進(jìn)HCC發(fā)病機(jī)制和索拉菲尼的耐藥性。
文章創(chuàng)新點
反復(fù)圍繞假設(shè)——驗證——假設(shè)——驗證的思路，圍繞一個中心點，將機(jī)制解析的非常透徹。很多老師做完代謝組以后就不知道該怎么往下走了，本文便提供了一個非常好的思路，值得咱們借鑒和學(xué)習(xí)。
“代謝組學(xué)”，找的是往下繼續(xù)做的方向，它其實是剛開始，而不是有些老師以為的研究的最終點。我們首先通過組學(xué)尋找到切入點，再對切入點的代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確定量，配以分子生物學(xué)手段進(jìn)行聯(lián)合驗證，最終得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。
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