卵巢癌為激素相關(guān)性腫瘤，是婦科腫瘤中的頭號死因，其發(fā)病隱匿、發(fā)展迅速、預(yù)后差，早期無特異表現(xiàn)，出現(xiàn)癥狀多已屬晚期。70%的患者就診時已是III期或IV期。盡管有了良好的手術(shù)治療和化療，但這部分患者的五年生存率還是在20%-40%之間，而I期的卵巢癌患者5年生存率可達(dá)90%。因此，有效地進(jìn)行早期診斷對提高卵巢癌患者生存率具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
目前，在卵巢癌早期診斷方面尚無有效方法。盡管有了很多新技術(shù)，但在卵巢癌的篩查中很難找到一種特異性和敏感度都高的單一指標(biāo)。病理學(xué)檢查是金標(biāo)準(zhǔn)，雖然影像學(xué)技術(shù)對卵巢癌的檢出有所幫助，但是所需儀器設(shè)備及技術(shù)條件要求高、費(fèi)用貴，不適用于普查。腫瘤標(biāo)志物之一的糖蛋白是一類含糖的蛋白質(zhì)，目前在卵巢癌診斷中的常用的糖蛋白有CA125、HE4、CA724、CA199等。CA125是目前FDA批準(zhǔn)的生物標(biāo)志物，用于臨床監(jiān)測對治療和復(fù)發(fā)的反應(yīng)，但其對患者生存的影響有限，同時CA125的假陽性率高。所以迫切需要發(fā)現(xiàn)HGSC（高分級漿液性卵巢癌）早期診斷生物標(biāo)志物的新策略。
近日，來自加拿大的Thomas Kislinge教授團(tuán)隊(duì)在國際學(xué)術(shù)期刊Cell Systems（IF=8.982）發(fā)表了文章。在該研究中，他們描述了一種蛋白質(zhì)組學(xué)策略，用于檢測HGSC患者來源的異種移植模型（PDX）血清中的腫瘤相關(guān)蛋白，同時使用來自HGSC患者的兩個獨(dú)立的縱向血清隊(duì)列，證明了概念驗(yàn)證的適用性。研究成果為高分級漿液性卵巢的早期診斷帶來了希望。
Kislinge教授就職于加拿大最大的腫瘤治療和研究機(jī)構(gòu)瑪格麗特公主癌癥中心，他的團(tuán)隊(duì)主要致力于將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于癌癥和心血管方面的研究。鑒于血清蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性，研究者開發(fā)了一個蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程，即使用臨床相關(guān)的HGSC PDX模型直接識別腫瘤相關(guān)蛋白。使用原位移植的PDX模型，他們可以在小鼠血清背景中輕松識別“人類獨(dú)特的”蛋白質(zhì)，從而克服與基于蛋白質(zhì)組學(xué)的生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)相關(guān)的限制。這種策略使他們能夠識別潛在的新型腫瘤相關(guān)蛋白。最后使用合成的、穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的肽，他們能夠快速開發(fā)用于HGSC患者血清中定量的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)測定。
一、基于PDX的N-糖蛋白組策略以檢測血清中的腫瘤相關(guān)蛋白
相關(guān)研究表明，細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)通常是N-糖基化的，并且這些蛋白質(zhì)可以分泌或脫落到細(xì)胞外環(huán)境中。因此，基于N-糖的富集可以是檢查血清中組織滲漏蛋白的有效策略。利用這一原理，作者開發(fā)了一種檢測腫瘤相關(guān)蛋白的新方法。簡言之，產(chǎn)生12種不同的PDX模型（手術(shù)切除HGSC腫瘤并進(jìn)而植入小鼠腹膜內(nèi)），在終點(diǎn)收集腫瘤組織（PDX-腫瘤）和血清（PDX-血清），以來自非移植的同基因小鼠的血清（NEGsera）作陰性對照（樣本策略），運(yùn)用label-free定量蛋白質(zhì)組加以分析（質(zhì)譜策略）。
正如預(yù)期的那樣，與對照組NEG血清相比，PDX-血清樣本與PDX-腫瘤樣本存在顯著差異。各樣品類型中共鑒定到3922個去糖基化位點(diǎn)，其中絕大部分去糖基化位點(diǎn)（約2077多個位點(diǎn)）僅在PDX-腫瘤中發(fā)現(xiàn)分布。PDX-腫瘤和PDX-血清中定量到649個位點(diǎn)，表明這些肽可用作HGSC生物標(biāo)記物（圖1D）?？傊?strong>基于PDX的N-糖蛋白組策略可以檢測血清中的腫瘤相關(guān)蛋白。
圖 1 N -糖肽的蛋白質(zhì)拓?fù)涠ㄎ慌cN-糖蛋白組的功能分析
二、細(xì)化物種分配以及PDX-血清/腫瘤中去糖基化位點(diǎn)的強(qiáng)度分布
由于最初的peptide assignment使用人和小鼠相連的方式，并在UniProt-同種型蛋白-FASTA數(shù)據(jù)庫（66763總序列）中進(jìn)行，顯然這不是非常全面的，所以作者一步改進(jìn)了物種匹配。該改進(jìn)包括將檢測到的肽序列與更全面的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫匹配，通過他們的優(yōu)化，將39個人類獨(dú)特的去糖基化位點(diǎn)的物種分配改變?yōu)槿?小鼠保守，同時也將兩個小鼠獨(dú)特的去糖基化位點(diǎn)改變?yōu)槿?小鼠保守（圖2E）。
與PDX-腫瘤相比，去糖基化位點(diǎn)在PDX-血清中具有更大的動態(tài)范圍（圖2F與圖2G，上圖對比）。經(jīng)典小鼠血清蛋白（即C4b，Mug1和Serpina3k）的去糖基化位點(diǎn)偏向PDX-血清中的較高強(qiáng)度，而HGSC相關(guān)蛋白（即FOLR1，CA125和MSLN）分布在中等至低-強(qiáng)度點(diǎn)。這些結(jié)果表明腫瘤相關(guān)蛋白會釋放到血液中，但是以較低濃度存在。然而，對PDX-腫瘤中去糖基化位點(diǎn)強(qiáng)度的類似分析顯示物種分布更均勻（圖2G，底部），表明移植的腫瘤相關(guān)蛋白和宿主衍生的基質(zhì)蛋白的豐度在腫瘤組織中更相似。
圖 2 PDX-血清/腫瘤中去糖基化位點(diǎn)的強(qiáng)度分布
三、從PDX樣品中選擇腫瘤相關(guān)蛋白
通過生物信息學(xué)分析，作者獲得了PDX-血清中各種豐度的蛋白質(zhì)功能注釋。作者將小鼠蛋白質(zhì)定位到它們的人類直向同源物中，產(chǎn)生總共745種獨(dú)特的蛋白質(zhì)（圖3A，左）。Acute-phase（參與炎癥的基因）、蛋白酶抑制劑、補(bǔ)體系統(tǒng)和絲氨酸蛋白酶是其中豐度相對較高的蛋白質(zhì)。與之相反的是，細(xì)胞表面、細(xì)胞間粘附分子、金屬蛋白酶、受體、ECM組分和信號素等組織滲漏和信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白在其中以中、低豐度存在。
有趣的是，更高豐度的蛋白通常來自于鼠源，驗(yàn)證了他們之前發(fā)現(xiàn)的PDX-血清蛋白質(zhì)中的物種偏倚（圖3A，右）。比較PDX-血清和PDX-腫瘤中定量到的1559個去糖基化位點(diǎn)的強(qiáng)度，表明人類獨(dú)特的去糖基化位點(diǎn)在PDX-腫瘤中具有更高的強(qiáng)度（圖3B）。接著，作者想使用獲得的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)從HGSC PDX模型中選擇候選肽用于開發(fā)靶向蛋白質(zhì)組學(xué)測定（圖3C）。總之，通過對HGSC PDX模型的比較和功能分析，他們鑒定了一組腫瘤相關(guān)肽，用于系統(tǒng)開發(fā)靶向蛋白質(zhì)組學(xué)測定。
圖3 潛在標(biāo)志物的選擇
四、PRM靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析
為了能夠?qū)碜訦GSC患者的血清中的腫瘤相關(guān)肽進(jìn)行定量，作者使用平行反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜（PRM-MS）系統(tǒng)地開發(fā)了靶向蛋白質(zhì)組學(xué)測定（圖4D）。他們通過優(yōu)化色譜梯度和標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量（NCE）來最大化測定響應(yīng)，并通過使用穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)（SIS）肽評估測定特異性。研究者快速開發(fā)了通過基于PDX的N-糖蛋白組學(xué)策略發(fā)現(xiàn)的408種肽的PRM-MS分析，成功率為90％（408/450）（圖4H）。
最后，在一項(xiàng)小概念驗(yàn)證研究中，他們將這些靶向分析應(yīng)用于來自HGSC患者的兩個縱向血清群組（n = 20，96血清）。他們證明通過基于PDX的N-糖蛋白組學(xué)策略發(fā)現(xiàn)的候選肽可在人血清中定量，并且通常也能模擬當(dāng)前HGSC生物標(biāo)志物CA125的表達(dá)譜。
圖4 靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析
總而言之，本文通過對HGSC PDX模型的比較和功能分析，使其能夠識別潛在的新型腫瘤相關(guān)蛋白，配合使用合成的、穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的肽，用于系統(tǒng)開發(fā)靶向蛋白組學(xué)檢測。當(dāng)然這一策略仍舊需要在更大的患者隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。
同時有理由相信，他們的實(shí)驗(yàn)策略應(yīng)該也能適用于具有可用PDX模型的其他癌癥類型。但不得不指出的是，這種策略也具有一定潛在的缺點(diǎn)（基于PDX的腫瘤相關(guān)蛋白的鑒定，通常上限于分析源自移植人癌細(xì)胞的人類獨(dú)特候選物）?？傊麄兲岢龅倪@一方法，可以為開發(fā)新的HGSC早期篩查標(biāo)志物帶來可能。
參考文獻(xiàn)
1. Zhang, H., et al. (2016). Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell.
2. Sinha A, et al. (2019). N-Glycoproteomics of Patient-Derived Xenografts: A Strategy to Discover Tumor-Associated Proteins in High-Grade Serous Ovarian Cancer.Cell Systems.
原創(chuàng)： Dr.Proteomics 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)與蛋白組學(xué)
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