Microbiome–metabolomics reveals gut microbiota associated with glycine?conjugated metabolites and polyamine metabolism in chronic kidney disease★★★★★
● 期刊：Cellular and Molecular Life Sciences
● IF=7.02
● 發(fā)表時間：2019-05-16
研究背景
隨著發(fā)病率和死亡率的增加，慢性腎病已成為一個主要的公共衛(wèi)生問題。慢性腎病患者患心血管疾病的風(fēng)險高于傳統(tǒng)的風(fēng)險因素。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素受體阻滯劑被認為是第一線治療方法，證明能有效延緩高血壓、心血管疾病和慢性腎病的進展。然而，許多使用這些藥物治療的慢性腎病患者還是會發(fā)展為終末期腎病(ESRD)，這突出了新療法對疾病干預(yù)的重要性。
各種臨床和動物研究已經(jīng)證明腸道微生物群在健康維持和疾病發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用。通過改變腸道的生化和生物物理環(huán)境，晚期慢性腎病會導(dǎo)致腸上皮屏障破壞和微生物生物失調(diào)。最近的研究闡明了慢性腎病對指向腎-腸軸的腸道微生物群的影響。慢性腎臟病已被證明導(dǎo)致腸道微生物群落的生物失調(diào)。對腸道微生物組-代謝組軸的更深入理解是改善慢性腎病發(fā)展過程中控制腸道微生物組的治療策略的先決條件。
研究方法
LC-MS/MS廣篩及靶向檢測、western blot、16s RNA、臨床指標
研究思路
一、構(gòu)建假手術(shù)組（sham）和腎臟切除組（NX）模型，收集樣本。臨床指標檢測、血清樣本LC-MS代謝組檢測、腸道樣本16s RNA檢測。關(guān)聯(lián)分析，鎖定相關(guān)通路。
二、構(gòu)建假手術(shù)組（sham）、腎臟切除組（NX）、腎臟切除給予茯苓組（NX+PC）以及腎臟切給予茯苓提取物組（NX+PAA）模型，靶向檢測上述通路中的物質(zhì)，配合WB驗證。
研究結(jié)果
慢性腎病大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變
與假手術(shù)組相比，慢性腎病大鼠的尿量、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、血清肌酸酐、尿素和蛋白尿顯著增加，而體重、肌酸酐清除率(CCr)和血細胞比容明顯降低(圖1a)。
16s結(jié)果顯示，sham組和NX組之間腸道菌群組成存在顯著差異（圖1b-c）。sham組和NX組從門到屬水平之間的差異(圖1d)。sham組和NX組的微生物群落主要由厚壁菌門和擬桿菌門組成，它們是鼠的典型腸道微生物群落結(jié)構(gòu)(圖1e)。厚壁菌和擬桿菌屬分別占sham組和NX組腸道細菌序列的71.1%、65.8%以及19.9%、27.5%。在低水平(低于3%)檢測到包括放線菌、變形菌等其他門群(圖1e)。NX組中變形菌豐度增加。在綱水平上，NX組β變形菌明顯增加，而α變形菌明顯減少(圖1f)。
圖1
慢性腎病大鼠腸道分類群的變化
在屬水平上，每個樣品平均72.3%的序列不能被注釋(圖1g)，與之前的報道一致。其余序列屬于91個屬，其中乳桿菌屬、真細菌屬、異桿菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、普雷沃氏菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、乳米諾球菌屬和羅勃氏菌屬在兩組中都非常豐富(圖1g)。PICRUSt分析預(yù)測，腸道微生物群的改變影響的代謝途徑(圖1h)。
LEfSe分析顯示NX組的主要特征是異桿菌屬、埃希氏志賀氏菌屬、梭菌屬、擬桿菌屬、乳球菌屬、布拉氏球菌屬和腸桿菌屬的豐度較高(LDA> 2.0，P < 0.05)，而sham組主要表現(xiàn)為假單胞菌屬、嗜堿菌屬、明串珠菌屬、乳球菌屬和梭菌屬ⅳ的豐度較高(LDA> 2.0，P < 0.05，圖2a，b)。OPLS-DA顯示，這些菌群可以顯著地將sham組與NX組分開(圖2c)。皮爾遜相關(guān)分析確定了幾個與NX組密切相關(guān)的分類群(圖2d)。為了確定NX組中生物化學(xué)參數(shù)與腸道菌群變化之間的相關(guān)性，對改變的13個腸道菌群和生物參數(shù)進行了斯皮曼相關(guān)分析。發(fā)現(xiàn)CCr和SBP與腸道微生物群的改變有很大關(guān)系(圖2e)。在相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中進一步觀察慢性腎病相關(guān)的13個屬以及9個生理生化參數(shù)之間的斯皮曼相關(guān)性(圖2f)。發(fā)現(xiàn)SBP和CCr是整個網(wǎng)絡(luò)的中樞，為生理參數(shù)和屬產(chǎn)生了兩個子網(wǎng)絡(luò)(圖2f)。結(jié)果表明，蛋白尿增加與紅細胞壓積降低之間的顯著正相關(guān)，與CCr無關(guān)。綜上所述，這些結(jié)果表明腎功能不全可能影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成。反過來，腸道菌群失調(diào)在腎功能受損的惡化中起著至關(guān)重要的作用。
圖2
慢性腎病引起腸道微生物群改變對潛在功能的影響
為了預(yù)測慢性腎病大鼠腸道微生物群改變的可能影響，通過PICRUSt 分析，OTUs被分配到數(shù)據(jù)庫中最近的參考基因組。PICRUSt分析顯示，471KEGG orthology(KO)與219個改變的代謝途徑相關(guān)，例如脂質(zhì)生物合成和代謝(鞘脂、脂肪酸、類固醇、膽汁酸)、氨基酸生物合成和代謝(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸)、氨基苯甲酸酯降解、苯丙素生物合成和MAPK信號途徑，它們與37種酶相關(guān)。代謝途徑和相關(guān)酶參與了33條代謝途徑的交替(圖1h)。腸道微生物群參與尿毒癥毒素的產(chǎn)生，包括對甲酚硫酸鹽(PCS)和吲哚酚硫酸鹽(IS)，后者對全身炎癥、腸道屏障結(jié)構(gòu)/功能的損害和慢性腎病的進展有很大作用。腸道微生物可以將磷脂酰膽堿和左旋肉堿轉(zhuǎn)化為三甲胺，三甲胺被肝黃素單加氧酶代謝為三甲胺氮氧化物(TMAO)，最終由腎臟排出。TMAO與腎纖維化、慢性腎病進展及其并發(fā)癥如動脈粥樣硬化和心血管疾病密切相關(guān)。
慢性腎病大鼠血清代謝組學(xué)的變化
代謝組結(jié)果，OPLS-DA顯示sham組與NX組有明顯區(qū)分(圖3a)。291個被鑒定的代謝物也可以很好的區(qū)分sham組與NX組(圖3d-f)。如圖3g所示，這些代謝物主要參與脂肪酸代謝(支鏈脂肪酸氧化、亞油酸、脂肪?；o酶a生物合成)、氨基酸代謝(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸等)、多胺代謝(亞精胺和精胺生物合成)和嘌呤代謝。值得注意的是，大多數(shù)代謝途徑與腸道微生物代謝有關(guān)，表明慢性腎病大鼠腸道微生物失調(diào)。此外，途徑相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)表明代謝途徑的失調(diào)也與甲基組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、絲氨酸、色氨酸和丁酸的代謝以及亞精胺、精胺、磷脂和脂肪酸的生物合成有關(guān)?？傊?，慢性腎病與氨基酸、多胺和脂質(zhì)代謝的改變密切相關(guān)。
圖三
慢性腎病誘導(dǎo)的腸道菌群與代謝失調(diào)的關(guān)系
對發(fā)病機制中的微生物菌群和代謝物進行斯皮爾曼相關(guān)分析。如圖4a所示，36種代謝物與13個改變的微生物屬顯著相關(guān)。酪氨酸和色氨酸的減少與梭菌ⅳ呈正相關(guān)，與Allobaculum、Clostridium_sensu_ stricto、埃希氏志賀氏菌、腸桿菌和布拉氏菌呈負相關(guān)。大多數(shù)代謝物如TMAO、甘氨酸、肉桂酰甘氨酸、苯乙酰甘氨酸、苯丙酰甘氨酸、精胺、亞精胺、丙烯醛、腐胺和N1-乙酰精胺在NX組中明顯增加，并與Clostridium_sensu_stricto、埃希氏志賀氏菌、腸桿菌屬、Parasutterella和布拉氏菌屬呈正相關(guān)，它們含有編碼參與甘氨酸結(jié)合代謝物和多胺代謝的酶的基因。
SBP和36種代謝物進行斯皮爾曼相關(guān)分析，顯示SBP與16種代謝物有關(guān)。有趣的是，十種化合物，如肉桂酰甘氨酸、2-苯乙酸、苯乙酰甘氨酸、苯丙酰甘氨酸和馬尿酸，是甘氨酸綴合的微生物代謝物(圖4c)。例如，馬尿酸是由苯甲酸和甘氨酸結(jié)合產(chǎn)生的，這種反應(yīng)發(fā)生在肝、腎和腸中。甘氨酸可以直接與苯丙酸偶聯(lián)，苯丙酸是厭氧菌的一種已知代謝副產(chǎn)物。這些發(fā)現(xiàn)表明甘氨酸的生物活性部分與慢性腎臟病引起的高血壓有關(guān)。甘氨酸共軛代謝物包括肉桂酰甘氨酸、苯丙酰甘氨酸、2-苯乙酸和馬尿酸的增加與埃希氏志賀氏菌、腸桿菌屬、Parasutterella和擬桿菌屬呈強正相關(guān)，與梭菌ⅳ呈強負相關(guān)。
圖4
代謝網(wǎng)絡(luò)建模和腸道菌群—代謝物——表型軸中微生物群和代謝物的關(guān)聯(lián)
為了評估腎功能對代謝物的潛在作用，我們使用腸道微生物群相關(guān)的36種代謝物對CCr和代謝物進行了Spearman相關(guān)和線性回歸分析。15種代謝物顯示與CCr顯著相關(guān)，線性回歸系數(shù)大于0.800(圖5a)。值得注意的是，這些代謝物屬于多胺代謝(精胺、亞精胺、丙烯醛、腐胺、3-氨基丙醛、N1-乙酰精胺和N1，N12-二乙?；?。多胺已被確定為尿毒癥毒素，可加速腎纖維化的進展。圖5b顯示了慢性腎病大鼠的多胺代謝途徑。
腸道菌群對宿主代謝活動的影響已被廣泛研究，其對局部和全身代謝都有很大貢獻。為了進一步探索臨床指標、細菌屬和代謝物之間的關(guān)聯(lián)，使用9個臨床指標、13個屬級細菌分類群、甘氨酸代謝途徑中的7個代謝物和多胺代謝中的6個代謝物的網(wǎng)絡(luò)分析，如圖5c所示，CCr與腸道微生物群的生物失調(diào)、臨床指標和代謝物直接相關(guān)，這表明腎功能下降與導(dǎo)致腎纖維化的微生物組成、甘氨酸代謝和多胺代謝相關(guān)。腸道微生物群與甘氨酸代謝和多胺代謝密切相關(guān)。有趣的是，高血壓與甘氨酸代謝和微生物群的失調(diào)呈高度正相關(guān)；然而，CCr與NX大鼠體內(nèi)上調(diào)的多胺代謝和微生物群有較高的負相關(guān)，著重說明了NX大鼠體內(nèi)微生物豐度的強烈變化與代謝調(diào)控之間的聯(lián)系。
圖5
PAA和PC對慢性腎病大鼠腸道菌群、血清代謝產(chǎn)物和腎纖維化的影響
為了證明腸道微生物群是否能影響腎纖維化，慢性腎病大鼠接受了PC治療，PC是一種著名的天然真菌，對慢性腎病具有顯著的抗氧化、抗炎、抗菌、利尿和抗纖維化作用。PAA是PC的主要四環(huán)三萜衍生物。如圖6a、6b所示，用PAA和PC處理改善了慢性腎病大鼠的甘氨酸和多胺代謝。有趣的是，PAA處理對甘氨酸代謝的影響比PC強。與PAA相比，PC處理在多胺代謝上相對更突出。此外，新出現(xiàn)的證據(jù)表明，腸道微生物群的改變在一定程度上是高血壓、尿毒癥毒素積累和腎功能下降的原因。推測PAA通過降低血壓改善腎功能并減輕間質(zhì)纖維化。然而，PC通過減少多胺衍生尿毒癥毒素的產(chǎn)生，部分改善了腎功能，減少了纖維化。目前的研究表明，用PAA和PC治療可以減輕慢性腎病及其后果(圖6c)。值得注意的是，PAA治療對改善腎功能的作用強于PC，這表明高血壓對慢性腎臟病進展的貢獻。此外，PAA和PC處理都能上調(diào)Z01、occludin和claudin-1的蛋白表達(圖6d，e)。
圖6
腸上皮屏障的破壞觸發(fā)了局部和全身炎癥和白細胞的流入，并加速了尿毒癥毒素在慢性腎病患者和動物的體循環(huán)中的轉(zhuǎn)移。NX大鼠表現(xiàn)出p65的顯著上調(diào)，這表明核因子κB信號的激活(圖7a)。κBα/NF-κB的激活伴隨著炎癥蛋白(包括單核細胞趨化蛋白-1和環(huán)氧合酶-2)的顯著上調(diào)，以及抗氧化系統(tǒng)(包括Nrf2及其下游基因產(chǎn)物，如HO-1、過氧化氫酶和NQO1)的下調(diào)(圖7a-d)。PAA和PC處理均抑制κB/核因子-κB通路的上調(diào)，并阻止細胞保護性Keap1/Nrf2通路的下調(diào)。有趣的是，PAA對這些途徑的影響比PC更強(圖7a-d)。
氧化應(yīng)激和炎癥在慢性腎病的發(fā)病和進展中起著至關(guān)重要的作用。與sham組相比，慢性腎病大鼠出現(xiàn)間質(zhì)炎癥細胞浸潤和腎小管萎縮/擴張(圖7e)。組織學(xué)分析表明，PAA和PC酯治療均顯著減輕腎損傷(圖7f)。免疫組織化學(xué)染色顯示，用PAA和PC處理均抑制包括α-SMA、vimentin和collagen Ⅰ內(nèi)的前纖維化因子的上調(diào)(圖7e)。這些結(jié)果表明PAA和PC治療可以減輕慢性腎病大鼠的炎癥和氧化應(yīng)激，并通過減輕微生物的生物失調(diào)、防止腸上皮屏障的破壞和減輕血清代謝物的失調(diào)來延緩腎纖維化。
轉(zhuǎn)載于邁維代謝
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