一、摘要
目的：研究代謝途徑紊亂對不同類型CAD的診斷價值。
方法：對來自4個獨立中心的2324例患者進(jìn)行隊列研究。疑似冠心病患者行冠狀動脈造影。將各組分為正常冠狀動脈(NCA)、非阻塞性冠狀動脈粥樣硬化(NOCA)、穩(wěn)定型心絞痛(SA)、不穩(wěn)定型心絞痛(UA)、急性心肌梗死(AMI)。采用液相色譜-四極飛行時間質(zhì)譜法測定血漿代謝組學(xué)，并進(jìn)行多元統(tǒng)計分析。
結(jié)果：研究人員與CAD進(jìn)行了12次交叉比較，并在CAD內(nèi)部對代謝紊亂進(jìn)行了表征。研究人員重點比較了NOCA與NCA、SA與NOCA、UA與SA、AMI與UA。其他比較包括SA與NCA、UA與NCA、AMI與NCA、UA與NOCA、AMI與NOCA、AMI與SA、顯著性冠心病(SA/UA/AMI)與非顯著性冠心病(NCA/NOCA)、急性冠狀動脈綜合征(UA/AMI)與SA。共鑒定出89種差異代謝物。代謝途徑的改變包括磷脂分解代謝減少、氨基酸代謝增加、短鏈?；鈮A增加、三羧酸循環(huán)減少等初級膽汁酸的生物合成。
結(jié)論：血漿代謝組學(xué)對代謝紊亂具有較強(qiáng)的特征性。小分子代謝物的差異可能反映了潛在的CAD，并可作為CAD進(jìn)展的生物標(biāo)志物。
二、材料方法
本文代謝組學(xué)研究分為兩個階段：第一階段生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，這項研究涉及2324名疑似心臟病患者，包括發(fā)現(xiàn)階段和驗證階段。研究人員將冠心病的不同階段與正常冠狀動脈進(jìn)行比較，確定和表征特定的代謝物和代謝途徑。本文重點研究了NOCA與NCA對斑塊形成的影響，SA與NOCA對斑塊生長的影響，UA與SA對冠狀動脈穩(wěn)定性向不穩(wěn)定性過渡的影響，以及AMI與UA的關(guān)系。研究路線(如圖1)所示。
圖1代謝組學(xué)實驗設(shè)計研究方案
三、樣本前處理方法
將患者的血樣儲存在K2 EDTA真空管中，同時，在冷凍室(4°C)中冷卻。然后在3000×g的條件下離心10分鐘，在2小時內(nèi)于4°C分離上清液，并轉(zhuǎn)移到新的小瓶中，然后立即冷凍保存(-80°C)，直到樣品制備。取150μl乙腈加入50μl的血漿，將混合物旋轉(zhuǎn)10秒。然后，在4℃下，對混合物進(jìn)行離心分離。以13000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。之后，將150μl上清液轉(zhuǎn)移到潔凈管中，并在室溫下在溫和的氮氣氣流下干燥。最后，用100μl水/乙腈(4:1)溶液(含0.1 mg/ml L-2氯苯丙氨酸為內(nèi)標(biāo)))溶解上清液。以1μl進(jìn)樣用于UPLC-Q/TOF-MS分析。
四、生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及鑒定
研究人員采用LC-MS技術(shù)對血漿樣本進(jìn)行高通量、高覆蓋代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集，同時結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘。
從近2000個代謝物中，研究人員發(fā)現(xiàn)、鑒定了與冠心病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的差異代謝物共89個，擾動的代謝通路主要包括磷脂代謝降低、多不飽和游離脂肪酸升高、氨基酸代謝升高、肉堿代謝升高、膽汁酸代謝減弱等(見圖2)。具體的組間差異代謝物的變化為E:NOCA與NCA之間，甘油磷脂、嘌呤和鞘脂類的代謝發(fā)生了變化F:SA和NOCA，甘油磷脂，纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，初級膽汁酸生物合成，精氨酸-脯氨酸G:UA和SA，甘油磷脂，丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸，精氨酸-脯氨酸H：AMI和UA，甘油磷脂，鞘磷脂和精氨酸脯氨酸(見圖3)。
圖2 冠心病不同臨床分型的差異代謝物及關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)
圖3 紊亂的代謝通路在比較組間時表現(xiàn)出不同的代謝物變化
圖4 紊亂的代謝通路相關(guān)聯(lián)系圖
從(圖4)中，可以看出，腸道微生物代謝增加，膽堿及和它的代謝產(chǎn)物三甲胺(TMA)和三甲胺n -氧化物(TMAO)升高。磷脂合成和分解代謝受到抑制，表現(xiàn)為磷脂酰甘油(PGs)、磷脂酰膽堿(PCs)、磷脂酰乙醇胺(PEs)和磷脂酰肌醇(PIs)的減少。鞘氨酸的代謝產(chǎn)物顯著升高，表明鞘磷脂代謝增強(qiáng)。SCAs水平的升高表明肉堿酸和脂肪酸代謝水平顯著升高。琥珀酸、富馬酸和蘋果酸等中間體呈下降趨勢，表示三羧酸(TCA)循環(huán)的抑制作用。幾種氨基酸代謝途徑被激活：具體包括苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和脯氨酸等。乙氧基去氧膽酸(ECDCA)和糖膽酸(GCA)水平顯示初級膽汁酸生物合成受到抑制。
五、生物標(biāo)志物驗證及臨床診斷價值的評估
基于ROC在發(fā)現(xiàn)階段的最高預(yù)測靈敏度和特異性，NOCA與NCA的最佳截斷值為0.635，SA與NOCA的最佳截斷值為0.205，UA與NCA的最佳截斷值為0.692。AMI和UA分別為0.475和0.475。然后使用截止值來預(yù)測CAD在測試階段和外部集的不同階段。在測試階段，NOCA與NCA的預(yù)測值分別為95.0%和91.5%(圖5E);測試階段SA與NOCA的比例為94.5%，驗證集為89.7%(圖5F);在測試階段，UA和SA分別為91.8%和96.4%驗證集(圖5G);在測試階段AMI和UA分別為96.0%和85.3%(圖5H)(見圖5)。
圖 5 生物標(biāo)記物臨床診斷價值的評估
本研究對4個獨立中心的2324名患者進(jìn)行了全面的代謝組學(xué)評估。表明冠心病患者與非冠心病患者以及冠心病類型之間存在顯著的模式差異。血漿樣本中有89種代謝產(chǎn)物受到顯著調(diào)控，這些變化表明冠心病可能涉及一種普遍的代謝紊亂。冠心病進(jìn)展過程中磷脂分解代謝和三羧酸循環(huán)減少，氨基酸代謝和短鏈酰肉堿增加，初級膽汁酸生物合成下降。代謝生物標(biāo)志物的組合提供了很好的預(yù)測價值，從正常冠狀動脈到另一種CAD類型。無冠狀動脈疾病組的335名(14.4%)參與者經(jīng)歷了心絞痛樣胸痛和不適，但經(jīng)血管造影證實動脈正常。與這一組進(jìn)行比較，可以區(qū)分癥狀混淆的患者。冠狀動脈阻塞程度與冠狀動脈粥樣硬化程度呈正相關(guān)。而對于CAD的嚴(yán)重性。所有NOCA患者均<50%。據(jù)計算，63.2%的SA、61.8%的UA和71.4%的AMI患者出現(xiàn)阻塞的概率小于70%。相比之下，只有一小部分UA或AMI患者的阻塞小于50%。
所以，研究人員又以顯著性CAD (NCA/NOCA)與非顯著性CAD (SA/UA/AMI)為例，對其特異性代謝途徑進(jìn)行了表征。代謝物發(fā)生顯著變化，用于鑒別診斷。在發(fā)現(xiàn)階段敏感性為83.3%，特異性為91.6%，在測試階段預(yù)測值為93.0%，在外部驗證集中預(yù)測值為100.0%。(圖6)
圖6中心插圖代謝組學(xué)特征和CAD類型的鑒別診斷
六、研究結(jié)論
1、研究人員創(chuàng)建了一個全面的代謝組學(xué)評估方法，以確定在CAD中臨床相關(guān)的干擾循環(huán)代謝物。
2、這一評估提高了對CAD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，并有助于用于篩選治療介入的靶點。
3、作為新型生物標(biāo)志物預(yù)測和區(qū)分CAD類型一種方法，這種方法可以減少不必要的冠狀動脈造影，提高預(yù)測價值，并補(bǔ)充目前的診斷方式。
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