腸道代謝對于人類健康至關重要。那么從出生起，第一個出現(xiàn)在嬰兒腸道中的微生物（群）是什么？菌群出現(xiàn)的先后順序及其后來的演替，對嬰兒以后的生活健康和疾病有哪些調(diào)控和影響呢？本研究創(chuàng)新性的關注了生命伊始，第一個“駐扎”在人體腸道的菌群及其代謝機制，采用生命最初幾天收集的糞便樣本評估了88名非裔美國人新生兒的腸道微生物組、蛋白質(zhì)組和代謝組變化，共同揭示了人類腸道中第一種微生物的深入表征，并闡釋了其外觀如何改變生化環(huán)境。
● 期刊：Nat Microbiol
● IF=14.3
● 發(fā)表時間：2020-04
研究路線
研究結(jié)果01
嬰兒隊列的宏基因組分析
我們收集了出生后2分鐘到176小時的88名健康的非洲裔美國人足月嬰兒的糞便樣品，這些樣品是胎糞和極早壽命的糞便樣品的混合物（表1）。
表1
宏基因組測序結(jié)果顯示大腸桿菌、糞腸球菌和尋常型擬桿菌是檢測到的最常見細菌（圖1a）。胎糞樣品中人類DNA的比例是雙峰分布的（高斯混合模型，P <0.001），其中一些樣品的人類DNA含量> 80％，另一些樣品的人類DNA含量<50％（圖1b）。出生后16小時內(nèi)收集的胎糞樣品中含有高水平的人類DNA。我們確定16 h構(gòu)成一個斷裂點（圖1c），即分娩后16小時內(nèi)收集到的糞便的測序表明，人類DNA水平高，而微生物DNA水平低。
Fig.1 | 胎糞樣品中的細菌和人類DNA
在胎糞中發(fā)現(xiàn)的細菌菌株沒有表現(xiàn)出單一的基因組特征
為了將胎糞大腸桿菌菌株置于所有大腸桿菌基因組的更大背景下，我們將裝配體與一組269個參考基因組進行了比較（圖2a）。來自胎糞的大腸桿菌基因組廣泛分布在發(fā)育樹上的組A，B1，B2和D1中（圖2b），并將大腸桿菌基因組分為三類（圖2c）。來自胎糞的基因組屬于每個組，相對于參考基因組，少數(shù)具有未分配功能的基因在胎糞樣品的基因組中更為普遍（圖2d）。我們沒有在糞便中鑒定出大腸桿菌菌株的強大基因組特征，這表明許多菌株可以作為新生兒腸道的先驅(qū)者。
Fig. 2 | 從胎糞樣品中組裝大腸桿菌元基因組
出生后胎糞中的細菌菌株的數(shù)量隨時間增加
細菌菌株的數(shù)量隨出生后的時間而增加（P <0.001；圖3a），估計每天積累1.2菌株（測定系數(shù)，R 2 = 0.46）。除了大腸桿菌，糞腸球菌和尋常型芽孢桿菌外，檢測到的最早的物種是來自腸桿菌科和芽孢桿菌的兼性厭氧菌，如鏈球菌和腸桿菌（圖3b）。出生后25小時檢測到專性厭氧菌，包括厭食芽孢桿菌，梭狀芽孢桿菌，巨球藻和韋永氏菌。僅在出生后>100 h收集的樣品中發(fā)現(xiàn)了雙歧桿菌。通過16S qPCR分析，發(fā)現(xiàn)菌株數(shù)目與細菌DNA絕對量呈正相關性（Spearmanρ= 0.7，P <0.001）；圖 3c）。對于大腸桿菌，從1個月時間點開始的17個樣品中有9個與出生樣品中組裝的確切基因序列的存在一致（圖3d）。從出生到1個月的細菌菌株保留率與大約50％的潛在發(fā)生率相一致，而尋常型芽孢桿菌的保留率最高。
Fig. 3 | 1月大嬰兒的胎糞中的細菌菌株及其保留
胎糞蛋白質(zhì)組的改變與出生后細菌的出現(xiàn)有關
根據(jù)包含人類、大腸桿菌、尋常型芽孢桿菌和糞腸球菌蛋白質(zhì)序列的參考數(shù)據(jù)庫，我們鑒定了1,071個人類蛋白質(zhì)和163個細菌蛋白質(zhì)。細菌蛋白的相對豐度很小，平均值為0.6％，但隨著出生后小時數(shù)的增加而增加（P = 0.01），并且通過qPCR產(chǎn)生的細菌與人的DNA的比率相對增加（P = 0.01；圖4a）。對人類蛋白質(zhì)豐度的主成分分析顯示，人類DNA含量較低的16小時后收集的樣品與其他樣品之間存在差異（P <0.001；圖4b）。進一步分析確定了53種人類蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在16h之前收集的胎糞中比16h之后在人類DNA水平較低的情況下收集的豐富（圖4c）?；谝阎牡鞍踪|(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析（圖4d），發(fā)現(xiàn)通過檢測微生物而減少的大量蛋白質(zhì)被連接到三個節(jié)點：SERPINA3，細胞分裂周期42（CDC42）和纖連蛋白1（FN1）。GTP結(jié)合蛋白CDC42在腸上皮的完整性中發(fā)揮關鍵作用，FN1是在腸的上皮基底膜和結(jié)締組織基質(zhì)35中發(fā)現(xiàn)的粘附糖蛋白。上皮相關蛋白的減少可能是由于胎兒腸道發(fā)育期間在子宮內(nèi)清除了積累的蛋白質(zhì)所致。
Fig. 4 | 胎糞樣品的蛋白質(zhì)組學
胎糞代謝組學揭示了差異豐富的特征，可預測厭氧微生物的代謝
我們調(diào)查了胎糞中的小分子，發(fā)現(xiàn)人類DNA含量高的樣品具有相似的代謝產(chǎn)物譜。在具有微生物定植和低水平人類DNA的樣品中，有45種代謝產(chǎn)物差異豐富（圖5a）。我們通過計算確定了厭氧條件下7種底物的最大ATP產(chǎn)量，并列出了在代謝組學結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的18種分子產(chǎn)物的量（圖5b）。為了進一步分析觀察到的混合氨基酸發(fā)酵，我們使用營養(yǎng)通量模型確定了乙酸鹽與琥珀酸鹽生產(chǎn)的不同比例下的ATP產(chǎn)量（圖5c）。接下來，我們試圖進一步探索在受控條件下氨基酸代謝和乙酸/琥珀酸生產(chǎn)的預測模式。我們在Luria-Bertani肉湯中培養(yǎng)了大腸桿菌，并通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/ MS）依次測量了培養(yǎng)基中的氨基酸水平，結(jié)果顯示大腸桿菌優(yōu)先利用氨基酸，其中絲氨酸在厭氧條件下顯示出最大程度的消耗，如通過1H核磁共振（NMR）測得的乙酸鹽生成量（圖5d）。蘇氨酸的含量也隨著糞便中細菌的檢測而降低（圖5a）。相比之下，在有氧條件下，氨基酸的消耗要復雜得多，首先是絲氨酸，然后是許多其他氨基酸（圖5e），這與以前在最少培養(yǎng)基中進行的實驗結(jié)果一致。
Fig. 5 | 胎糞樣品的代謝組學和大腸桿菌氨基酸的使用
研究結(jié)論
本實驗基于蛋白+微生物+代謝組學聯(lián)合分析，研究了88名非裔美國人新生兒的糞便樣本，發(fā)現(xiàn)三種最早的物種即大腸桿菌，糞腸球菌和尋常型擬桿菌及新生兒腸道菌落的基因組特征。此外，細菌的出現(xiàn)與大約50種人類蛋白質(zhì)的豐度降低、游離氨基酸水平降低以及細菌發(fā)酵產(chǎn)物（包括乙酸鹽和琥珀酸鹽）的增加有關。通過流量平衡模型和體外實驗，證明了氨基酸的發(fā)酵為厭氧條件下大腸桿菌（最常見的早期定居者）的初始生長提供了一種機制。這些結(jié)果提供了人類腸道中第一種微生物的深入表征，并顯示了其外觀如何改變生化環(huán)境。
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