2017年5月，《Cell》雜志連續(xù)刊登了美國(guó)西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院研究人員的工作，他們分離了來自肺癌病人腫瘤組織、正常肺組織以及外周血的免疫細(xì)胞，利用TCR測(cè)序和質(zhì)譜流式（CyTOF）等技術(shù)對(duì)細(xì)胞特定轉(zhuǎn)錄本和表面30多個(gè)蛋白Marker進(jìn)行檢測(cè)分析，繪制了早期肺腺癌腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的詳細(xì)圖譜。根據(jù)測(cè)序比對(duì)和質(zhì)譜流式的分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)早期的腫瘤就已經(jīng)開始在改變其微環(huán)境中的免疫細(xì)胞組成和表型了，尤其是T細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)髓系細(xì)胞（TIM）。
數(shù)據(jù)結(jié)果
作者利用Phenogragh（一種以Unsupervised方式進(jìn)行細(xì)胞分群的生物信息學(xué)分析工具），將T細(xì)胞（CD3+cells）分為21個(gè)具有不同表面marker表達(dá)模式的亞群：
通過對(duì)這些亞群各個(gè)Marker的表達(dá)情況我們可以得知，其中有的亞群對(duì)應(yīng)于我們已知的一些T細(xì)胞亞群，例如亞群I是CD4+Th1CM，亞群VI是Treg，但還有一些以前傳統(tǒng)手段未識(shí)別出來的新亞群（例如亞群IX、XX等）。
通過對(duì)比這些亞群在不同樣本中的比例，作者發(fā)現(xiàn)亞群VI（Treg）、亞群V（CD4+PD1+T）等多個(gè)亞群特異的出現(xiàn)在腫瘤組織中，提示這些亞群與腫瘤的發(fā)生過程有著密切的聯(lián)系。
作者接下來進(jìn)一步研究了腫瘤組織中靶向分子PD-1與不同T細(xì)胞亞群間的關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示PD-1僅在腫瘤組織CD4+和CD8+細(xì)胞中顯著表達(dá)；通過ImmunoSEQ方法對(duì)細(xì)胞樣本TCRbeta鏈的CDR3區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)雖然在腫瘤組織和正常肺組織中總體的TCR克隆型并無(wú)明顯差異，但是在腫瘤組織中TCR克隆的形成和擴(kuò)增明顯和CD8+PD-1+T細(xì)胞亞群特異性相關(guān)，且多發(fā)于TLS富集的腫瘤病灶區(qū)域，該現(xiàn)象在正常肺組織中并未觀察到。
同樣，作者用類似的方法分析了CD3-細(xì)胞，將B細(xì)胞和髓系細(xì)胞精細(xì)的分為了20個(gè)亞群，通過對(duì)比這些亞群出現(xiàn)在不同組織的比例，作者發(fā)現(xiàn)了在腫瘤組織和正常肺組織內(nèi)免疫細(xì)胞亞群構(gòu)成和功能的巨大差異。例如，DC細(xì)胞（也成樹突狀細(xì)胞）在誘導(dǎo)腫瘤免疫的過程中發(fā)揮了重要的抗原遞呈作用。在這項(xiàng)研究里，這類細(xì)胞被分為兩個(gè)表型不同的亞群：CD141+DC和CD1c+DC，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明兩群細(xì)胞具有不同的活性，相比之下，除了細(xì)胞表面的一些重要的免疫功能相關(guān)受體有表達(dá)有差別外，前者的溶酶體相關(guān)基因具有更高表達(dá)水平。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)，作者發(fā)現(xiàn)CD141+DC在腫瘤組織中的比例顯著低于正常肺組織，而CD1c+DC則差異不大。
與T細(xì)胞的結(jié)果類似，DC細(xì)胞亞群和功能的變化也反映了腫瘤組織中免疫細(xì)胞功能的失調(diào)。后續(xù)的分析表明，類似的變化還出現(xiàn)在NK細(xì)胞、單核細(xì)胞（Monocyte）、巨噬細(xì)胞（Macrophage）等細(xì)胞類型。這些信息匯總起來，充分說明肺癌腫瘤免疫微環(huán)境的系統(tǒng)性改變。以往的研究，一般專注于T細(xì)胞功能的改變，這項(xiàng)研究是對(duì)已有腫瘤免疫理論的重要補(bǔ)充和細(xì)化。相應(yīng)的，在腫瘤的免疫治療領(lǐng)域，主要也還是以激活T細(xì)胞為主（例如CAR-T，各種免疫檢查點(diǎn)類的抗體藥物），如果能采取措施活化腫瘤組織浸潤(rùn)的髓系細(xì)胞加以配合，很有可能大幅提高免疫治療的效果。
研究意義
盡管該研究尚未直接改變目前的癌癥治療方案，但來自Dana-FarberCancerInstitute的免疫學(xué)家W.NicholasHaining教授指出，該研究的重要性絕不局限于具體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而在于所拓展的研究方向——腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞組成對(duì)患者預(yù)后的指示性作用及對(duì)癌癥治療的指導(dǎo)意義。
“我們需要對(duì)數(shù)百名癌癥患者、數(shù)十種腫瘤類型進(jìn)行研究，達(dá)到對(duì)每個(gè)樣本要能分析數(shù)千個(gè)免疫細(xì)胞的水平，”他說道：“這是我們?yōu)榱私膺@背后的生物學(xué)機(jī)制所必須做的?！?/p>
如何對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行精確細(xì)分？
已有報(bào)道數(shù)據(jù)顯示，目前僅以一到兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)來推斷T細(xì)胞或巨噬細(xì)胞狀態(tài)的做法，很可能會(huì)遺漏掉重要的信息(ref2)。傳統(tǒng)方法多用流式細(xì)胞分析技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行亞群分析，然而由于方法學(xué)上的限制，目前在單一樣本上很難進(jìn)行數(shù)十種參數(shù)的同時(shí)檢測(cè)。
腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（上）和T細(xì)胞（下）分型的蛋白標(biāo)記物(ref2)
Fluidigm公司的質(zhì)譜流式專利技術(shù)，利用金屬元素標(biāo)簽進(jìn)行抗體標(biāo)記，大量去除背景噪音對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，并有效避免了傳統(tǒng)方法下檢測(cè)信號(hào)間的交叉重疊，無(wú)需熒光補(bǔ)償。利用Helios質(zhì)譜流式細(xì)胞儀可對(duì)樣本同時(shí)進(jìn)行超過40種參數(shù)的高效檢測(cè)，不僅可用于常規(guī)樣本檢測(cè)，更可解決某些臨床珍貴樣本量少的問題；同時(shí)通過單樣本多參數(shù)檢測(cè)，可對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行全面綜合分析，避免了“盲人摸象”現(xiàn)象的產(chǎn)生。
另一方面，在T細(xì)胞研究中，TCRα、β鏈上的可變區(qū)域序列信息是分析T細(xì)胞克隆亞型的關(guān)鍵信息之一，其多變性和復(fù)雜性往往對(duì)T細(xì)胞分群和功能研究造成很大影響。區(qū)別于文章中所用的ImmunoSEQ方法僅針對(duì)群體細(xì)胞樣本TCR的3’-end和CDR區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，F(xiàn)luidigm公司與Sanger和EMBL-EBI等機(jī)構(gòu)在單細(xì)胞水平合作開發(fā)了新的TCR序列分析方法——TraCeR(ref3)，該方法通過C1系統(tǒng)制備單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組后進(jìn)行測(cè)序分析，數(shù)據(jù)不僅可以提供TCR全部可變區(qū)域序列信息，更可進(jìn)行TCR全長(zhǎng)序列分析，基于該分析結(jié)果能夠準(zhǔn)確、細(xì)致鑒別各種環(huán)境下的T細(xì)胞克隆亞型，對(duì)樣本中復(fù)雜的T細(xì)胞群的表型和功能進(jìn)行精確分析。該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了從細(xì)胞捕獲到核酸制備全部過程的自動(dòng)化，可快速制備單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組、全基因組及靶向序列的核酸樣本。
Reference：
1.InnateImmuneLandscapeinEarlyLungAdenocarcinomabyPairedSingle-CellAnalyses.LavinY.etal.,Cell169(2017):750-766
2.AnImmuneAtlasofClearCellRenalCellCarcinoma.ChevrierS,etal.,Cell169(2017):736-749.
3.Tcellfateandclonalityinferencefromsingle-celltranscriptomes.StubbingtonMJ,etal.,NatMethods13(2016):329-332
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