幾十年來，糖發(fā)酵及以變異鏈球菌（Streptococcusmutans）為代表的產(chǎn)酸菌一直被認(rèn)為是齲病的主要病因，大多數(shù)預(yù)防措施和齲病風(fēng)險評估方法也都是針對變異鏈球菌。近年來對齲損部位基于核酸的研究揭示了口腔中存在極其多樣化的生態(tài)系統(tǒng)，其中變異鏈球菌只是這個生態(tài)系統(tǒng)中極小的一部分。齲病相關(guān)微生物群落是指定植在口腔中的微生物中與齲病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)的、多種微生物有規(guī)律的組合，齲病生態(tài)病因?qū)W理論認(rèn)為齲病的發(fā)生發(fā)展是微生物群落失衡的結(jié)果。
第二代高通量測序和宏基因組技術(shù)的發(fā)展使口腔微生物多樣性被充分證實，牙菌斑中變異鏈球菌只占0.1%，齲損部位變異鏈球菌占0.7%～1.6%。因此有必要對口腔菌斑樣本進(jìn)行DNA和RNA的提取分析，進(jìn)一步明確引起齲病發(fā)生和發(fā)展的微生物“名單”，以及其表達(dá)的遺傳目錄?；诳谇晃⑸锖怂岬姆治鐾瑫r也對死亡的、一過性的或者惰性存在的微生物進(jìn)行了計量，從而過高估計微生物的多樣性并對分析造成干擾。要明確齲病發(fā)生發(fā)展的原因，不僅要找出與疾病相關(guān)的微生物“名單”，還應(yīng)了解它們協(xié)同作用發(fā)揮功能的具體機(jī)制，包括對參與這個過程的蛋白質(zhì)及代謝物進(jìn)行研究，對多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合來研究。
不同的組學(xué)方法已開始用于了解齲病發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，從應(yīng)用的角度看，齲病病因的多組學(xué)研究在口腔疾病的風(fēng)險評估以及潛在的診斷價值上能提供更多的信息。本文將從其基因組學(xué)、宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白質(zhì)組學(xué)和宏代謝組學(xué)等方面對齲病相關(guān)口腔微生物的多組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
1.基因組學(xué)與宏基因組學(xué)（genomicsandmetage-nomics）
1.1基因組學(xué)與宏基因組學(xué)的定義
基因組學(xué)是分子生物學(xué)中研究有機(jī)體中一整套的遺傳物質(zhì)的學(xué)科。而宏基因組學(xué)是研究直接從環(huán)境中獲取的樣本中的遺傳物質(zhì)，宏基因組學(xué)的研究可揭示細(xì)菌培養(yǎng)的方法所忽略的“巨大的”微生物多樣性，為觀察微生物世界提供了一個強(qiáng)大的“透鏡”，有可能顛覆我們對整個生物世界的理解。新型的宏基因組學(xué)研究方法用于分析物種多樣性時可以最小化假陽性率并獲得可靠的相對豐度。
1.2齲病患者微生物基因組具有鑒別特征
高通量測序是上世紀(jì)90年代中后期發(fā)展起來的測定DNA分子中核苷酸的精確順序的方法，目前應(yīng)用中的包括單分子實時測序（single-moleculereal-timesequencing，pacificbiosciences）、離子激流測序（ionsemiconductor，iontorrentsequencing）、焦磷酸測序、合成測序（sequencingbysynthesis，illu-mina）、連接測序（sequencingbyligation，SOLIDse-quencing）、新型納米孔測序（nanoporesequencing）和鏈終止法測序（chaintermination，sangersequenc-ing）等等。
新一代高通量在基因組學(xué)研究中的應(yīng)用為認(rèn)識群落結(jié)構(gòu)、研究群落差異和功能提供了良好的契機(jī)。就唾液菌群中的細(xì)菌譜系和功能基因組成進(jìn)行深入解析，闡釋成人唾液微生物群落的生態(tài)特性，通過對齲活躍人群和健康人群的比較分析后發(fā)現(xiàn)兩者在基因和群落結(jié)構(gòu)上具有鑒別特征。另外，有研究者利用基因組指紋圖譜分析（genomicfingerprintanalysis）對比了3～4歲的無齲兒童和重度低齡兒童齲（severeearlychildhoodcaries，S-ECC）患兒唾液中變異鏈球菌和表兄鏈球菌（Streptococcussobrinus）的基因型多樣性，發(fā)現(xiàn)在3～4歲兒童中這兩種細(xì)菌具有遺傳多態(tài)性，且變異鏈球菌具有比表兄鏈球菌較高的遺傳多態(tài)性，而S-ECC患兒中這兩種細(xì)菌均比無齲患兒有更多的基因型。
1.3齲病微生物群落的時空多樣性
1.3.1齲病微生物群落的時間多樣性
微生物的群落組成變化影響著齲病的臨床進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。齲病按臨床進(jìn)展?fàn)顟B(tài)分為活躍性齲和靜止性齲。Neves用定量聚合酶鏈反應(yīng)對患有ECC的兒童齲損部位的特定幾種細(xì)菌種屬進(jìn)行識別和量化，結(jié)果顯示雙歧桿菌（Bifidobacteriumspp.）和干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）在牙本質(zhì)活躍性齲壞中含量較高，而內(nèi)氏放線菌（Actinomycesnaeslundii）、輕型鏈球菌（Streptococcusmitis）和戈登鏈球菌（Streptococcusgordonii）在活躍性齲和不活躍性齲損樣本中含量沒有明顯差異，非活躍性齲損部位變異鏈球菌相對較高，雙歧桿菌和干酪乳桿菌與活躍性齲成明顯正相關(guān)。嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophi-lus）（OR=15.1）和戈登鏈球菌（OR=7.7）的陽性檢測結(jié)果與活躍性齲明顯相關(guān)。
1.3.2齲病微生物群落的空間多樣性
一個宏基因組學(xué)研究表明，在釉質(zhì)齲的微生物群落中，編碼參與飲食中的糖酵解、細(xì)胞表面粘附以及酸應(yīng)激反應(yīng)（acidstressresponses）的基因過表達(dá)；而牙本質(zhì)齲的微生物群落中，其復(fù)合糖酵解和酸應(yīng)激反應(yīng)的基因表達(dá)水平很低。相反地，牙本質(zhì)齲中過表達(dá)的基因包括：參與單糖和雙糖的代謝的基因、參與編碼滲透壓應(yīng)激反應(yīng)（osmoticstressresponses）的蛋白，比如甘油攝取蛋白（glyceroluptakeproteins）和水通道蛋白（aquaporins）的基因、編碼膠原粘附及纖維連接蛋白的基因以及編碼一系列肽酶包括膠原酶（collagenases）和氨肽酶（aminopeptidases）的基因等。
該研究認(rèn)為齲病具有組織依賴性，關(guān)于齲病病因的探索需要更高的精度。在齲病進(jìn)展的不同階段，齲病相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)不同，且不同個體之間也不相似，提示不同組別的微生物可能執(zhí)行相同的功能。這是人類微生物組的宏基因組學(xué)研究的大概趨勢，完全不同的微生物類別組成可引起驚人的相似功能。將高通量測序與宏基因組學(xué)結(jié)合，可更好地揭示微生物群落中不同細(xì)菌在齲病發(fā)生發(fā)展中的作用。
2.宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)（metatranscriptomics）
2.1宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的定義
轉(zhuǎn)錄組是一個細(xì)胞或細(xì)胞群的所有的信使RNA分子，也被稱為基因表達(dá)譜。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究包括mRNA的提取與分析，提供復(fù)雜微生物群落的基因調(diào)控和表達(dá)概況的信息。目前RNA測序技術(shù)迅速發(fā)展，逐漸取代了芯片為主導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)。
2.2口腔微生物宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究目標(biāo)
基于微生物DNA分析技術(shù)對口腔微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，齦上菌斑中約有500～700種細(xì)菌。而該估值在唾液中會更高，刺激性唾液中該估值達(dá)到1000～2000種，可能是因為唾液與口內(nèi)所有位點(diǎn)都有接觸。然而，無論是在早期齲、釉質(zhì)齲還是牙本質(zhì)中齲、深齲，在齲損部位其微生物種類估值急劇減少至100～200種。以上這些基于口腔微生物DNA的PCR擴(kuò)增的研究中檢測到的微生物中有些不具有活性且不會造成齲病進(jìn)展。以RNA為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)可以識別積極參與轉(zhuǎn)錄的細(xì)菌，將樣本中與齲相關(guān)的微生物種類縮減至40～160種，可推測這些微生物是齲壞組織中有活性的微生物。因此，探索齲病病因有必要對口腔微生物群落進(jìn)行基于RNA的研究，即從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，從而獲得真正的齲病相關(guān)的微生物“名單”。
2.3齲病在宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面的研究
一項以口腔微生物RNA為基礎(chǔ)、研究牙面菌斑的研究檢測了進(jìn)食前后的口腔生物膜中活躍的微生物群體，明確了攝入食物后活性增強(qiáng)的細(xì)菌，前提是這些細(xì)菌能酵解糖并產(chǎn)酸。另外，通過人的口腔微生物鑒定芯片技術(shù)（humanoralmicrobeidentificationmicroarray，HOMIM）分析了無齲兒童和S-ECC患兒的唾液和牙菌斑樣本后結(jié)果顯示，鏈球菌屬（Streptococcus）、卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）和放線菌屬（Actinomy-ces）與S-ECC密切相關(guān)，可能是乳牙齲的潛在生物標(biāo)志物。因此，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)為發(fā)現(xiàn)齲病標(biāo)志物以預(yù)測疾病發(fā)生從而早期進(jìn)行防治提供了可能。
通過宏轉(zhuǎn)錄組方法推測的齲相關(guān)的微生物列表中，變異鏈球菌在隱匿性牙本質(zhì)齲洞中的活躍性微生物中占0.02%，開放的牙本質(zhì)齲占0.48%，釉質(zhì)齲占0.73%。宏轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)表明活性菌只是口腔生物膜中所有微生物群落中的一部分，但仍具有很高的多樣性。決定齲損部位的活性細(xì)菌，可能最終揭示齲病難以把握的微生物學(xué)病因，為患齲風(fēng)險評估及早期預(yù)防開拓道路。目前已有學(xué)者利用生態(tài)建模技術(shù)（ecologicalmodelingtechniques）提出了口腔微生物的低齡兒童齲預(yù)測模型，可以預(yù)見，若將該技術(shù)與宏轉(zhuǎn)錄組技術(shù)相結(jié)合運(yùn)用于齲病的研究，將得到更有診斷價值的預(yù)測模型。
3.宏蛋白質(zhì)組學(xué)（metaproteomics）
3.1宏蛋白質(zhì)組學(xué)的定義
蛋白質(zhì)組是指在一定時間內(nèi)由基因組、細(xì)胞、組織或生物體所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)組。更具體地說，它是在給定的時間內(nèi)，在給定條件下，在給定的細(xì)胞或生物體中表達(dá)的蛋白質(zhì)的集合。蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組的研究，宏蛋白質(zhì)組學(xué)是研究直接從環(huán)境中獲得的樣本中的蛋白質(zhì)組的學(xué)科。雖然基因芯片（microarray）的研究可以揭示細(xì)胞中不同mRNA的相對量，但mRNA水平并不直接與相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平成線性關(guān)系。
研究口腔微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)有助于了解口腔微生物群落的功能輸出，從而有可能通過促進(jìn)或阻斷某功能輸出的方法來干預(yù)口腔疾病的發(fā)生發(fā)展。
3.2口腔微生物組的宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究
運(yùn)用“鳥槍法”（shotgunproteomics）研究人類口腔微生物組的宏蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)了50種細(xì)菌屬。Belda-Ferre等首次對人類口腔生物膜進(jìn)行了宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析，建立了人類牙菌斑的第一個可用蛋白質(zhì)庫。同時發(fā)現(xiàn)，健康個體有較多的L-乳酸脫氫酶（L-lactatedehydrogenase）和精氨酸酶（argininedeiminase）系統(tǒng)，它們都參與pH緩沖，其他表達(dá)水平較高的蛋白質(zhì)參與了胞外多糖的合成、鐵代謝與免疫反應(yīng)。對有齲和無齲的成人口腔生物膜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析明確了參與L-乳酸脫氫酶、精氨酸酶系統(tǒng)的蛋白質(zhì)，這些系統(tǒng)有助于pH緩沖，且在無齲個體的齦上菌斑中高表達(dá)。
這些研究為齲病的防治提供了更多可能性，已經(jīng)有研究表明，精氨酸可以通過重塑口腔微生物群落改善口腔pH穩(wěn)態(tài)。另外，有研究者對比了齲病及牙周病患者與正常人唾液的宏蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示，與正常組相比，疾病組唾液中補(bǔ)體系統(tǒng)和炎癥標(biāo)志物顯著過表達(dá)，而疾病組與正常組的細(xì)菌蛋白組圖譜及功能注釋具有相似性，這說明口腔疾病的狀態(tài)與補(bǔ)體系統(tǒng)及炎癥相關(guān)的蛋白質(zhì)過表達(dá)有關(guān)，且唾液中的微生物不表達(dá)疾病相關(guān)的代謝特征。
3.3宏蛋白組學(xué)研究與早期齲
口腔細(xì)菌生產(chǎn)的脲酶可生成氨，對口腔生態(tài)產(chǎn)生重大影響，從而影響口腔健康。關(guān)于早期（3～6歲）口腔環(huán)境的代謝平衡以及群落的生態(tài)研究揭示了脲酶活性與堿生成與牙菌斑組成之間的重要相關(guān)性。某些共生細(xì)菌，比如巴斯德菌（pasteurel-laceae），其脲酶活性對口腔酸堿平衡有積極的影響，可在低糖消耗的牙菌斑中抑制耐酸菌及致齲菌，如纖毛菌（Leptotrichia）變異鏈球菌。然而，唾液中的脲酶活性增高與高齲風(fēng)險和變異鏈球菌水平增高相關(guān)。這種情況表明，口腔早期細(xì)菌群落的蛋白質(zhì)組相互作用非常復(fù)雜，某些蛋白質(zhì)分子可作為齲病早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防的標(biāo)記物。因此，將對生態(tài)群落的組學(xué)研究和高通量的分析方法結(jié)合起來，可為早期齲的發(fā)生提供一個清晰、系統(tǒng)的描繪，且可以發(fā)現(xiàn)齲病早期診斷的潛在標(biāo)志物。
4.宏代謝組學(xué)（metabolomics）
4.1宏代謝組學(xué)的定義
代謝組是指生物樣本中發(fā)現(xiàn)的小分子化合物的完整集合。代謝組學(xué)是對生物體內(nèi)化學(xué)過程中涉及到的代謝產(chǎn)物的研究。具體來說，就是對特定細(xì)胞過程留下的獨(dú)特化學(xué)“印跡”的系統(tǒng)研究，研究它們的小分子代謝物圖譜。目前應(yīng)用最廣泛的代謝組學(xué)研究方法是氣相色譜法（gaschromatography），特別是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）。由口腔微生物群落中細(xì)菌的多樣性及其組織依賴性可知，群落中的不同微生物組合行使不同的功能，成組的細(xì)菌也可能行使同一功能。因此有必要對微生物群落影響齲病發(fā)生發(fā)展的代謝過程進(jìn)行研究，繼而通過干預(yù)該過程來控制齲病的發(fā)展。齲齒的生態(tài)學(xué)說認(rèn)為，重點(diǎn)關(guān)注微生物群落代謝產(chǎn)物而忽略該過程中所涉及的微生物，可作為理解和控制疾病的一個線索。從應(yīng)用的角度看，檢測齲病相關(guān)的代謝譜，在患齲風(fēng)險評估以及潛在的診斷價值上能提供更多的信息。
4.2齲病相關(guān)宏代謝組學(xué)研究
關(guān)于早期口腔整個代謝組的分析表明，乳牙列、混合牙列和恒牙列患齲兒童的唾液中其代謝物各有不同。與正常組相比，其乳酸、乙酸和丁酸含量增高。且正常組兒童的唾液中，雖然口腔衛(wèi)生習(xí)慣、社會經(jīng)濟(jì)學(xué)地位以及飲食不同，但其代謝物組成相似。此外，患齲兒童復(fù)合樹脂修復(fù)治療3個月后的唾液代謝組表現(xiàn)出丙酸、乙酸、丁酸和寡糖明顯下降，并伴有變異鏈球菌和乳酸桿菌培養(yǎng)水平的下降。對患齲兒童的唾液代謝組分析結(jié)果表明，參與精氨酸-脯氨酸代謝通路和連接精氨酸和堿生成的酸堿平衡中代謝產(chǎn)物具有突出作用。
還有研究者對成人齦上菌斑中的微生物代謝組進(jìn)行了糖酵解途徑（embden-meyerhof-parnaspathway，EMPpath-way）、戊糖磷酸途徑（pentosephosphatepathway）和三羧酸循環(huán)（tricarboxylicacidcycle，TCA）糖代謝方面的分析，結(jié)果顯示齦上菌斑中包含了除戊糖磷酸途徑中赤鮮糖-4-磷酸（erythrose4-phosphate）以外的所有糖代謝物。且在葡萄糖沖洗后，糖酵解途徑中的葡萄糖-6-磷酸（glucose6-phosphate）、果糖-6-磷酸（fructose6-phosphate）、果糖1，6-二磷酸（fructose1，6-bisphosphate）、磷酸二羥丙酮（dihydroxy-acetonephosphate）和丙酮酸以及戊糖磷酸途徑中的6-磷酸葡萄糖酸（6-phosphogluconate）、核酮糖5-磷酸（ribu-lose5-phosphate）和7-磷酸景天庚酮糖（sedoheptu-lose7-phosphate），乙酰輔酶a（acetylcoa）增加。同時，糖酵解途徑中的3-磷酸甘油酸（3-phosphoglycer-ate）和磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenol-pyruvate），以及三羧酸循環(huán)中的琥珀酸（succinate），延胡索酸（fu-marate）和蘋果酸（malate）均下降。這些在齦上菌斑觀察到的通路及代謝產(chǎn)物的變化類似于在鏈球菌和放線菌中的代謝譜整合。齲病相關(guān)的微生物群落組成及群落之間的聯(lián)系多樣、巨大，相關(guān)代謝組學(xué)的研究仍有很大空間。
5.小結(jié)
盡管對人類口腔微生物的群落組成了解得越來越多，但是對于微生物的原位活動以及微生物與微生物、微生物與環(huán)境之間的相互作用了解仍然有限。關(guān)于齲病相關(guān)微生物組學(xué)的研究開展了很多，但仍有很大的研究空間，若能將微生物組學(xué)研究與高通量測序的方法結(jié)合起來應(yīng)用在齲病病因?qū)W的研究上，不僅將進(jìn)一步揭示齲病在微生物組學(xué)方面的病因，同時將會為齲病的預(yù)防、患齲風(fēng)險評估甚至治療開辟出新的道路。
浙公網(wǎng)安備33010802007965號