關(guān)于隊列研究
隊列研究（cohortstudy）是流行病學研究的基本設(shè)計之一,目前被廣泛地應用于系統(tǒng)生物學和精準醫(yī)學研究的各個領(lǐng)域。隊列研究對一組人群在縱向的不同時間間隔內(nèi)進行抽樣，并對獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，來評估各種因素和變量對結(jié)果的貢獻程度。因為隊列研究涉及到對多個個體間眾多樣品的檢測，因此隊列研究檢測結(jié)果的準確性將會極大地影響統(tǒng)計學分析的結(jié)果以及所得結(jié)論的準確性。
今天我們將要具體介紹的兩篇文章，都是根據(jù)使用HD4discovery代謝組學平臺對英國的雙胞胎隊列TwinsUK的樣品進行分析得到的結(jié)果而發(fā)表的。
關(guān)于TwinsUK：
TwinsUK由風濕病學專家TimSpector教授于1992年使用WellcomeTrust和關(guān)節(jié)炎研究運動組織（ARUK）提供的資助設(shè)立，目前由倫敦國王學院的雙胞胎研究所維護。TwinsUK隊列已包括來自英國各地的12,000個雙胞胎，平均年齡五十多歲，是英國唯一的也是世界上臨床數(shù)據(jù)最全的成人雙胞胎隊列數(shù)據(jù)庫。
全球60多個研究團隊已經(jīng)采用TwinsUK隊列進行研究并發(fā)布了600多篇研究論文。最近的兩個有關(guān)腸道菌群研究和全基因組關(guān)聯(lián)分析的文章在進行代謝組學測試的時候都選擇了Metabolon的DiscoveryHD4?代謝組學平臺。
一、腸道菌群關(guān)聯(lián)研究
人體腸道微生物在健康中起著關(guān)鍵作用，影響激素、維生素以及支鏈氨基酸的循環(huán)水平，與諸如肥胖癥和胰島素抵抗等問題都有關(guān)聯(lián)性，但微基生物的16SrRNA測序分析和鑒定缺乏具體定量注釋的功能，亦不能指示每個細菌基因組內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄活性或區(qū)分活菌和死菌。而通過糞便的代謝組學研究，能特別報道出宿主、飲食和腸道微生物群之間的代謝相互作用，并通過提供微生物組的功能讀數(shù)（functionalreadout）來補充測序獲得的信息。
2018年由包括來自倫敦國王學院，HumanLongevityInc.和Metabolon等七家研究單位的作者（Ziereretal.）在NatureGenetics上發(fā)表了題為Thefecalmetabolomeasafunctionalreadoutofthegutmicrobiome（糞便代謝組作為腸道微生物組的功能讀數(shù)）的文章（NatureGenetics,2018,50:790-795）。文章中作者對TwinsUK隊列中獲取的786個個體的糞便使用了MetabolonDiscoveryHD4?非靶向代謝組學平臺進行了檢測，以研究糞便代謝物與年齡、性別、BMI、肥胖程度、宿主基因差異以及腸道菌群組成的單-多變量的關(guān)聯(lián)性。
通過研究檢測出了1,116個代謝物的水平，發(fā)現(xiàn)不同個體間的遺傳因素對糞便代謝物的影響只有17.9％（heritability(H2)），屬于適度范圍。在所鑒定的代謝物中，570種是常見的并且在至少80％的樣品中都能檢測到，而有345種只能在20％至80％的樣品中檢測到（圖一a）。
▲圖一a：糞便代謝物測量數(shù)量
通過對上述570種常見代謝物進行的多變量PLS-DA分析得出，糞便代謝物的成分能夠?qū)⒆钅觊L的十分位數(shù)人群（>75歲）與最年輕的十分位數(shù)人群（<56歲）區(qū)分開來（曲線下面積=0.71，P=6.8×10-6），其中一種代謝產(chǎn)物，植烷酸（phytanate），在最年長和最年輕的十分位數(shù)人群之間存在顯著不同（P=5.0×10-3）。這些結(jié)果表明糞便代謝組與年齡之間存在非線性關(guān)聯(lián)，這與先前關(guān)于年齡對腸道微生物組影響的報道一致（圖二）。
▲圖二：糞便代謝組與年齡的關(guān)聯(lián)性
其后，Ziereretal.通過對比內(nèi)臟脂肪量，一個衡量腹部肥胖的標準，并校正了BMI的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)了總共102個具有統(tǒng)計學意義的關(guān)聯(lián)代謝物指標，它們共同解釋了在內(nèi)臟脂肪中觀察到的28.4％的總方差。
新出現(xiàn)的證據(jù)還表明腸道微生物群通過與膳食組分的相互作用影響內(nèi)臟發(fā)育。Ziereretal.這篇文章亦驗證了內(nèi)臟脂肪量與腸道微生物組成之間存在很強的關(guān)聯(lián)性。且與BMI相比，糞便代謝物與內(nèi)臟脂肪相關(guān)的程度更深，并突出了腸道代謝過程對腹部肥胖的強烈影響。
內(nèi)臟脂肪水平與43個糞便氨基酸（均為正相關(guān)）（n=647）和32個OTU（n=540）呈顯著相關(guān)（6個橙色為正相關(guān)，26個綠色為負相關(guān)）。紅方塊表明這些代謝物與OTU之間存在正相關(guān)關(guān)系（β>0）;藍方塊表示負相關(guān)（β<0）;灰方塊表示無顯著關(guān)聯(lián)（FDR>5％）。微生物與糞便代謝物的關(guān)聯(lián)性符合它們各自與內(nèi)臟脂肪的關(guān)聯(lián)性，因此表明微生物的代謝譜對比分類學與宿主表型的關(guān)系更加密切。
糞便代謝組與向心性肥胖之間的強烈關(guān)聯(lián)證實了微生物氨基酸代謝參與肥胖的假設(shè)，并提出了新的影響機制，如微生物維生素B的代謝影響。
在以前的研究中，Ziereretal.發(fā)現(xiàn)幾種微生物能使接受人類糞便移植物的無菌小鼠的內(nèi)臟脂肪量較低，體重增加減少。通過此次糞便代謝組分析，Ziereretal.發(fā)現(xiàn)這些微生物的水平與較低的氨基酸水平密切相關(guān)，因此表明它們與內(nèi)臟脂肪的相關(guān)性可能與氨基酸含量相關(guān)（圖3）。這種關(guān)聯(lián)可能是由于這些細菌的增加氨基酸的利用或減少氨基酸的產(chǎn)生，或者可能是更復雜的宿主-微生物相互作用的結(jié)果。
▲圖三：通過糞便代謝物與腸道微生物組之間的關(guān)聯(lián)性探究微生物對內(nèi)臟脂肪的影響
NAT2基因位點與糞便代謝特征有關(guān)（表一）。NAT2基因編碼N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，催化咖啡因代謝物的降解。NAT2的表達在肝臟中最高，其與糞便中咖啡因衍生的代謝物的濃度相關(guān)。通過比較咖啡因與糞便代謝產(chǎn)物5-乙酰氨基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶和1,3-二甲基尿酸之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們的比例與咖啡攝入量和血清咖啡因水平呈正相關(guān)。
▲表一：糞便代謝物與基因的關(guān)聯(lián)
最后，糞便代謝組的檢測結(jié)果可以較好地反映腸道菌群的不同組成，平均能夠解釋將近70％的腸道菌群組成差異，而且糞便代謝組的變化與內(nèi)臟脂肪量密切相關(guān)，說明腸道菌群可能通過某些機制對腹部肥胖造成影響。由此提出糞便代謝分析是探索微生物組成，宿主表型和遺傳復雜性狀之間聯(lián)系的新工具。
二、多組學關(guān)聯(lián)研究
2017年，美國的人類長壽研究所HumanLongevityInc.在自然遺傳雜志NatureGenetics上發(fā)表了名為Whole-genomesequencingidentifiescommon-to-rarevariantsassociatedwithhumanbloodmetabolites（全基因組測序鑒定與人血液代謝物相關(guān)的常見至罕見變異）的文章(Longetal.,NatureGenetics,2017,49:4,568-578)，通過全基因組測序（GWAS）和血清代謝組學分析來進行全基因組與代謝組最大的一次關(guān)聯(lián)性研究。該研究挑選TwinsUK的1,960名成年人的血清樣本進行代謝組檢測并試圖把代謝物水平和常見、低頻和罕見的三種遺傳變異進行關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有101個基因突變與246種代謝物的水平變化呈顯著相關(guān)（P≤1.9×10-11）。有113個個體攜帶可能影響17個基因功能的罕見雜合突變，這17個基因中有13個與先天性遺傳代謝缺陷或其他兒科遺傳病癥相關(guān)。該項研究發(fā)現(xiàn)了更多的影響代謝組水平的基因突變，并強調(diào)了罕見的雜合突變在影響成人血液代謝異常表型中的重要性。
Longetal.在長達18年的三個不同時間點，收集了來自1,960名受試者的血清樣本，包括413對單卵雙胞胎和552對異卵雙胞胎。圖一中，極坐標代表了基于八個超級生化代謝通路（氨基酸，碳水化合物，輔酶和維生素，能量代謝物，脂類，核酸，多肽和外源物）的644個代謝物的遺傳度變化區(qū)間（h2），總體而言，高遺傳度和一致性表明代謝物作為一種中間表型是遺傳關(guān)聯(lián)分析的理想選擇。
▲圖一：644個血清代謝物的遺傳度
通過GWAS分析常見（MAF>5％）和低頻（0.5％<MAF≤5％）的遺傳突變，發(fā)現(xiàn)在所有超級代謝通路途徑中有246個代謝物變化與101個基因座呈顯著相關(guān)（P≤1.9×10-11）（圖二）。
▲圖二：代謝物水平與基因位點關(guān)聯(lián)的Manhattan圖
Longetal.對93個擁有異常代謝物水平的個體進行研究，發(fā)現(xiàn)10個基因上的14個罕見突變，這之中有27個個體代謝物水平超過平均值達4SD，且所有罕見突變都是雜合子。通過研究這些變異和遺傳代謝?。ù蟛糠譃槌Ｈ旧w隱性遺傳）的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)了5個基因：與乳清酸尿癥相關(guān)的UMPS（MIM258900）與二甲基甘氨酸脫氫酶缺乏癥有關(guān)的DMGDH（MIM605850），與短鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥相關(guān)的ACADS（MIM201470），與戊二酸血癥II型相關(guān)的ETFDH（MIM231680）和與肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥相關(guān)的CRAT（MIM606175）（圖四）。
▲圖四：在具有特異血清代謝物水平的異常個體中定位稀有變異
通過和已知遺傳變異比較來說明新發(fā)現(xiàn)的變異在遺傳代謝病中可能的功能作用，Longetal.在圖五中顯示了ACADS編碼的結(jié)構(gòu)以及與短鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥相關(guān)的新變異和已知變異的位置。發(fā)現(xiàn)兩個罕見變異與已知變異位置呈聚集狀態(tài)：c.596C>T|p.Ala199Val變異位于β-sheetdomain上孟德爾變異c.529T>C|p.Trp177Arg附近，并且c.1066G>A|p.Ala356Thr變異在C-末端α-螺旋結(jié)構(gòu)上的幾個孟德爾變異附近。這兩種新變異可能導致與鄰近單體的空間沖突，導致蛋白功能的喪失。
▲圖五：ACADS的結(jié)構(gòu)可視化
總體而言，該項研究成功證實了代謝物的定量性狀可以與包括同源基因在內(nèi)的遺傳信息聯(lián)系起來。
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