生物標志物是指可供客觀測評的某種特征性生化指標，通過對它的測定可以獲知機體所處的生物學(xué)進程。檢查一種疾病的特異性生物標志物，可對疾病的診斷及預(yù)防起到關(guān)鍵作用。
在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，生物標志物的研究思路，一般分為三個階段：標志物的篩選（Discovery）,標志物的驗證（Verification）和標志物的確認（Validation）。標志物的篩選通常需要借助高通量的組學(xué)手段，對大規(guī)模臨床樣本進行代謝組學(xué)或蛋白組學(xué)測定，篩選到具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異代謝物或蛋白，經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物信息學(xué)分析，篩選出目標生物標志物。接下來的驗證階段，需要對更小范圍的生物標志物進行靶向蛋白質(zhì)組學(xué)或靶向代謝組學(xué)的大樣本量驗證，統(tǒng)計分析，計算靶標標志物的特異性與靈敏度。如果想要自己的研究結(jié)果更加完整，還可以利用臨床樣本，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進行補充驗證，如ELISA、WB等。
2017年，由德國格賴夫斯瓦爾德大學(xué)在Gut（IF=17.016）期刊上發(fā)表的題為“Metabolicbiomarkersignaturetodifferentiatepancreaticductaladenocarcinomafromchronicpancreatitis”的研究就是運用代謝組學(xué)技術(shù)確定生物標志物的典型實例。
臨床上，胰腺癌被稱為“癌癥之王”，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。而慢性胰腺炎（Chronicpancreatitis，CP）是胰腺癌的危險因子，且臨床上兩者之間難以區(qū)分，容易導(dǎo)致早期胰腺癌的誤診和治療的延遲。由于原有的標志物效果不佳，這一系列事實促使研究者們努力尋找其替代性生物標志物。
此研究中，共招募914名受試者，分別為:胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC，271位）、慢性胰腺炎（CP，282位）、肝硬化（LC，100位），以及健康獻血者（BDs）和術(shù)前非胰腺疾病患者的261份對照樣本，采用脂質(zhì)組學(xué)（非靶向分析，類固醇和脂質(zhì)）在內(nèi)的LC-MS和GC-MS多種代謝組學(xué)平臺對914例樣本進行檢測（圖1）。應(yīng)用三階段生物標志物開發(fā)策略（探索集，訓(xùn)練集和測試集）共鑒定到477種代謝物。
圖1實驗設(shè)計
最終基于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)研究結(jié)果找尋到了9個潛在的生物標志物，將這9個代謝物與現(xiàn)有胰腺癌診斷血液指標CA19-9聯(lián)合使用，組合標志物群甚至可檢測出98％的可切除胰腺癌，準確率達90.4％。組合標志物的AUC顯著高于CA19-9的AUC（0.94對0.85，p<0.001），敏感性（89.9％比74.7％，p<0.01）和特異性（91.3％比77.5％，p<0.05）也顯著改善（圖2）。
圖2 生物標志物的ROC曲線
不僅僅是代謝組學(xué)，在一些疾病生物標志物的研究中，蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用越來越廣泛。且多組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用大勢所趨，接下來讓我們通過另外一個研究實例向大家介紹多組學(xué)技術(shù)在篩選生物標志物過程中不可或缺的作用。
案例二同為德國格賴夫斯瓦爾德大學(xué)2017年的研究，其成果被刊登在BMCMedicine（IF=8.097）雜志上。題為“Plasmaproteomeandmetabolomecharacterizationofanexperimentalhumanthyrotoxicosismodel”。研究者旨在篩選表征人血漿促甲狀腺激素（TSH）和游離甲狀腺素（FT4）相關(guān)特征的生物標志物。利用甲狀腺毒癥模型進行研究，又通過隨機森林經(jīng)過兩階段交叉程序，驗證篩選的生物標志物是否可以區(qū)分甲狀腺功能異常。
研究策略：
經(jīng)代謝組、蛋白組數(shù)據(jù)統(tǒng)計，共鑒定到380種代謝物與497種人類蛋白質(zhì)（圖3）。為確保數(shù)據(jù)的可用性，通過過濾分析，只挑選缺失值低于40％的代謝物和蛋白質(zhì)用于后續(xù)分析，即349種代謝物和437種蛋白質(zhì)進行下一步的分析。
圖3 差異代謝物功能富集分析（左）、差異蛋白功能富集分析（右）
為尋找新的biomarker來分類TH狀態(tài)，研究者通過兩階段交叉驗證程序建立了一個隨機森林分類器，綜合分析差異代謝物和差異蛋白。最終，獲得包含代謝物和蛋白質(zhì)在內(nèi)的15個物質(zhì)（圖4）。30次驗證結(jié)果均顯示出穩(wěn)定、良好的分類能力，可以作為潛在的Biomarker。
圖4 生物標志物篩選
以上兩篇高水平論文，分別基于代謝組學(xué)，和代謝+蛋白組學(xué)的方法篩選出了差異代謝物和蛋白。結(jié)合相應(yīng)的驗證分析篩選出目標生物標志物。
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