2017年Jeffrey C. Hall, Michael Rosbash , Machael W. Young三位美國遺傳學(xué)家因在晝夜節(jié)律（也稱生物鐘）分子調(diào)控機(jī)制研究中取得突破性進(jìn)展而榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，他們的研究揭示了植物、動(dòng)物及人類如何調(diào)節(jié)自身生物節(jié)律。時(shí)隔一年，Jerzy Adamski教授及其研究團(tuán)隊(duì)在Cell上發(fā)表《Atlas of Circadian Metabolism Reveals System-wide Coordination and Communication between Clocks 》論文，采用代謝組學(xué)技術(shù)研究不同組織的晝夜節(jié)律代謝物輪廓進(jìn)而揭示了生物鐘之間的協(xié)調(diào)和通訊。
大量流行病學(xué)和動(dòng)物研究證據(jù)指出晝夜節(jié)律在個(gè)體健康層面的重要性。晝夜節(jié)律允許細(xì)胞和組織在精確的時(shí)間和空間內(nèi)劃分代謝途徑，特定的代謝途徑是生物鐘的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，機(jī)體代謝物隨生物鐘波動(dòng)從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)可及性。代謝物是生物鐘和新陳代謝之間的重要媒介，通常作為替代診斷和預(yù)測生物標(biāo)志物來界定機(jī)體的健康或病理學(xué)狀態(tài)。在能量平衡條件下不同組織的生物鐘可以精確同步并維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，而組織間平衡的破壞會(huì)增加代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，可見機(jī)體代謝和生物鐘是密不可分的。
Jerzy Adamski研究團(tuán)隊(duì)以正常飲食（Chow）和高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠10周后，每4小時(shí)收集小鼠8個(gè)部位的生物樣本：視交叉上核（SCN）、內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（mPFC）、腓腸肌、肩胛間棕色脂肪組織（BAT）、附睪白色脂肪組織（WAT）、肝臟、血清和附睪尾部精子（Fig.1A），采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)和氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS) 聯(lián)用技術(shù)對(duì)(ZeitgeberTime, ZT) 0h, 4h, 8h, 12h, 16h, 20h, 24h七個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的生物樣本進(jìn)行代謝組學(xué)全譜分析，每個(gè)組織中檢測涵蓋系列代謝物類別的數(shù)百種代謝物(Fig.1B, 1C)，并繪制出24小時(shí)代謝動(dòng)態(tài)圖。
時(shí)間和組織特異性代謝物分析
代謝物數(shù)量、時(shí)間波動(dòng)和HFD對(duì)代謝影響存在組織特異性差異(Fig.1B)，不同組織的代謝物類別基本相似(Fig.1C)，相對(duì)代謝物豐度則體現(xiàn)了組織成分不同(Fig.1D)：WAT和BAT以脂質(zhì)為主；腦和肌肉主要為氨基酸和脂質(zhì)；肝臟和血清主要為碳水化合物、氨基酸、脂類和能量代謝物； 精子則主要包含脂質(zhì)和能量代謝物。HFD的影響因組織而異(Fig.1C, 1E)，在mPFC和腓腸肌中檢測到約540種代謝物（腓腸肌和mPFC分別有232, 75個(gè)代謝物因HFD出現(xiàn)顯著變化），受HFD影響最大的是WAT、肝臟、BAT、腓腸肌和血清，大約40％-60％的代謝物出現(xiàn)顯著改變（Tab. 1），SCN、mPFC和精子則分別僅有27％, 14％和8％的代謝物發(fā)生改變。通路富集分析篩選出由HFD改變的特定脂質(zhì)類別，包括長鏈脂肪酸、多不飽和脂肪酸（PUFA）、二酰基甘油、磷脂、鞘脂、甘油脂和溶血脂。代謝物參與氨基酸代謝，精氨酸、脯氨酸、賴氨酸、支鏈氨基酸（BCAA）、二肽都受到高度影響。代謝物豐度的改變顯示組織病理學(xué)特征（Fig.1F），在Chow組中碳水化合物占肝臟代謝物的53％，而僅有8％碳水化合物受HFD發(fā)生顯著改變；Chow組中脂質(zhì)僅占11％，而HFD改變了52％的脂質(zhì)（Fig. 1D），表明肝臟脂肪變性。在HFD組中腓腸肌檢測到大量脂質(zhì)，已知其會(huì)對(duì)胰島素敏感性產(chǎn)生負(fù)面影響。
IG. 1 24小時(shí)內(nèi)小鼠組織的全譜代謝物組分析
HFD對(duì)24小時(shí)代謝的組織特異性影響
比較晝夜節(jié)律代謝物揭示了不同組織24小時(shí)代謝的差異性。血清、BAT、肝臟、骨骼肌和mPFC都是代謝高度活躍的組織（Fig.2），無論飲食如何，都有20％-50％的代謝物顯現(xiàn)出24小時(shí)內(nèi)的節(jié)律波動(dòng)。脂質(zhì)是每種組織中檢測到最多的一類（Fig.1C），而兩種不同飲食的組織中循環(huán)脂質(zhì)數(shù)量差異較大（Fig.2），Chow組BAT、mPFC和血清比SCN、肌肉、WAT和肝臟檢測到更多的循環(huán)脂質(zhì)，但HFD組BAT、mPFC和血清未見脂質(zhì)節(jié)律波動(dòng)，SCN卻可見100個(gè)重新波動(dòng)的脂質(zhì)。Chow組BAT、mPFC和血清中24h循環(huán)脂質(zhì)到白晝期有著顯著的時(shí)間門控，每種組織的峰值略有不同，脂質(zhì)分別在mPFC（ZT-6）、血清（ZT6-ZT8）和BAT（ZT8-ZT10）達(dá)到峰值。Chow組骨骼肌在24小時(shí)循環(huán)代謝物峰的分布上更具多樣性和暫時(shí)性，碳水化合物、核苷酸、氨基酸分別在ZT2、ZT8、ZT18達(dá)到峰值。HFD組氨基酸峰值在ZT8-ZT10附近，ZT20處出現(xiàn)次級(jí)峰，可見HFD組肌肉氨基酸代謝大量重組。與疾病相關(guān)的代謝物富集體現(xiàn)了與“骨骼肌退化”的關(guān)聯(lián)，凸顯了潛在的病理學(xué)基礎(chǔ)。晝夜代謝物富集揭示了常見的和組織特異性的代謝物類別。確實(shí)，慢性HFD會(huì)導(dǎo)致腓腸肌萎縮，而血清和肌肉的BCAA代謝物維持穩(wěn)健的24小時(shí)波動(dòng)卻不依賴于飲食，而在HFD組血清和肌肉還觀察到甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝物的晝夜節(jié)律富集。在HFD組，肌肉組織可見丙氨酸和天冬氨酸代謝相關(guān)代謝物的24小時(shí)波動(dòng)，而BAT中含有鳥嘌呤的嘌呤核苷酸出現(xiàn)波動(dòng)。
FIG.2 晝夜節(jié)律代謝物的比較分析
代謝物相關(guān)性顯示代謝途徑的組織特異性時(shí)間門控
代謝通路時(shí)間門控的連貫性對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)是必需的，代謝物的時(shí)間相關(guān)性可以作為組織內(nèi)單個(gè)細(xì)胞同步的一般指標(biāo)，因?yàn)閯?dòng)態(tài)通路在同步細(xì)胞之間應(yīng)該是高度相關(guān)的。在所有組織中代謝物之間存在廣泛的正\負(fù)時(shí)間相關(guān)性（Fig.3A和Fig.3B），有趣的是HFD組中許多組織喪失了代謝物相關(guān)性，HFD組血清、BAT、肝臟和肌肉分別損失98％, 74％, 34％和39％，表明肝臟和肌肉中代謝途徑出現(xiàn)維持或重組，血清中代謝物相關(guān)性的嚴(yán)重喪失對(duì)營養(yǎng)干預(yù)如何加劇組織間的失調(diào)有重大影響。根據(jù)代謝物類之間或之內(nèi)的正/負(fù)時(shí)間相關(guān)性進(jìn)行可視化（Fig.3C），血清脂質(zhì)與氨基酸顯示出最強(qiáng)的時(shí)間相關(guān)性，而在HFD組這一相關(guān)性顯著降低。 HFD組BAT中核苷酸、脂質(zhì)和氨基酸之間正相關(guān)性丟失。HFD組中肌肉和肝臟同樣喪失了代謝物類別之間的時(shí)間相關(guān)性，但其維持了包括氨基酸和碳水化合物之內(nèi)的大量代謝物相關(guān)性，比如肌肉糖酵解中間體和肝糖代謝物保持時(shí)間相關(guān)性。HFD血清中除了幾種中鏈脂肪酸和溶血脂質(zhì)外，必需脂肪酸失去相關(guān)性，而肌肉在?；鈮A和三羧酸（TCA或Krebs）循環(huán)代謝物之間失去相關(guān)性。HFD血清和肌肉中BCAA和其他氨基酸之間的相關(guān)性，表明組織間存在協(xié)調(diào)反應(yīng)。
采用時(shí)間關(guān)聯(lián)可以重建24小時(shí)內(nèi)的代謝途徑。例如，肌肉糖酵解中間體和?；鈮A分別反應(yīng)細(xì)胞質(zhì)或線粒體ATP產(chǎn)生情況，兩類代謝物都顯示出24小時(shí)動(dòng)態(tài)波動(dòng)（Fig.3D）。Chow組代謝物在不同時(shí)間窗口出現(xiàn)峰值可以反映晝夜變化規(guī)律，糖酵解中間體在白晝期下降，而?；鈮A增加。當(dāng)糖酵解中間體在夜間增加時(shí)，?；鈮A則降到最低。HFD組糖酵解中間體在黑暗期被鈍化，而酰基肉堿仍保持在峰值水平，這些代謝物協(xié)同改變意味著代謝適應(yīng)性受損并可能誘導(dǎo)胰島素抵抗。
FIG.3 組織特異性代謝物相關(guān)性
組織間時(shí)鐘通訊：代謝物的協(xié)調(diào)與失調(diào)
組織間代謝物時(shí)間相關(guān)性圖揭示了組織間的代謝偶聯(lián)（Fig.4A）。血清成為Chow組代謝物相關(guān)性的主要來源，強(qiáng)調(diào)了時(shí)間通訊中血清循環(huán)代謝物的作用，因?yàn)檠宕x物可指導(dǎo)和反映組織特異性代謝。HFD組血清、肌肉、肝臟和BAT代謝物時(shí)間連貫性出現(xiàn)嚴(yán)重喪失（Fig.4B, 4C），比較其跨組織相關(guān)性凸顯了HFD引起的代謝物相關(guān)性的喪失與重組（Fig. 5）。肝臟-血清與肌肉-血清代謝物相關(guān)性在HFD上降低了約60％，而BAT-血清相關(guān)性減少了74％。Chow組中血清和其他組織之間相關(guān)的主要代謝物類別是脂質(zhì)和氨基酸（占60％-70％），BAT和血清中的核苷酸顯示出相對(duì)較高的時(shí)間相關(guān)性。HFD組大多數(shù)跨組織代謝物相關(guān)性丟失，組織間脂質(zhì)損失約80％，氨基酸損失35％-66％。大多數(shù)HFD組織間代謝物相關(guān)性在Chow組沒有重現(xiàn)，這些新出現(xiàn)的相關(guān)性在肌肉、血清和肝臟氨基酸中尤為普遍，再次突出了連接這些組織的協(xié)調(diào)代謝反應(yīng)。
FIG. 4 HFD組織間代謝物相關(guān)性的喪失
FIG. 5 血清、肝臟、肌肉和BAT交叉組織代謝物相關(guān)性
HFD增加肌肉蛋白代謝與肝臟葡萄糖和甘油生成增加有關(guān)
本研究數(shù)據(jù)揭示了顯著的HFD特異性代謝物相關(guān)性和重新波動(dòng)，肌肉蛋白降解的增加與肝臟葡萄糖和甘油生成相關(guān)。如Fig.6所示，Chow組肌肉、肝臟谷氨酰胺和丙氨酸的晝夜節(jié)律被門控到不同的時(shí)間窗口，Chow組循環(huán)丙氨酸在整個(gè)晝夜周期中相對(duì)穩(wěn)定，但HFD組變得高度起伏并且在白晝期間增加，這種效應(yīng)在HFD組骨骼肌更加明顯，丙氨酸在白晝期間升高。而HFD組肝臟或WAT中丙氨酸變化并不明顯，BAT中略微降低。骨骼肌中丙氨酸產(chǎn)生和釋放的增加通常是對(duì)饑餓期間蛋白質(zhì)分解增加的反應(yīng)。肌肉蛋白質(zhì)降解的速度臨床上常通過3-甲基組氨酸來推斷，本研究僅在Chow和HFD組血清和骨骼肌中檢測到3-甲基組氨酸且都表現(xiàn)出24小時(shí)波動(dòng)，HFD組3-甲基組氨酸峰值顯著增加，表明肌肉蛋白質(zhì)降解增加。
甘油3-磷酸是甘油酯-甘油和極低密度脂蛋白合成的主要前體，其在HFD組晝/夜循環(huán)中增加了約50％（Fig. 6C），并且與肌肉和血清中的丙氨酸波動(dòng)一致，表明血清丙氨酸轉(zhuǎn)化為肝臟甘油三酯。時(shí)間上相關(guān)的肌肉和血清3-甲基組氨酸的上升和下降很大程度上反映了內(nèi)源性血清皮質(zhì)酮和胰島素的24小時(shí)波動(dòng)（Fig. 6D）。研究結(jié)果表明慢性HFD可局部增強(qiáng)對(duì)內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的敏感性，事實(shí)上，HFD組血清葡萄糖仍保持在較高水平，而小鼠肝臟和肌肉中的葡萄糖變化被削弱的同時(shí)又有升高并在ZT12達(dá)峰（Fig.6E），與內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的峰值相對(duì)應(yīng)（Fig.6E）。Fig.6F總結(jié)了HFD組肌肉，血清和肝臟代謝物之間的致病關(guān)系，結(jié)果表明肌肉蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，尤其是肌肉丙氨酸的產(chǎn)生和釋放，在代謝疾病中具有過去未曾認(rèn)識(shí)到的致病性。
FIG.6 增加肌肉和血清代謝物的晝夜節(jié)律波動(dòng)與肝臟葡萄糖和甘油生成增加有關(guān)
HFD組BAT中嘌呤核苷酸的波動(dòng)與UCP1活性受損相關(guān)
甘油和非酯化脂肪酸（NEFA）的組織特異性變化反映了組織間持續(xù)的脂質(zhì)更新和運(yùn)輸處于動(dòng)態(tài)平衡中，即在組織內(nèi)和組織間發(fā)生高速率的脂質(zhì)降解、相互轉(zhuǎn)化和再酯化，而總體脂肪含量保持恒定。HFD減緩了循環(huán)NEFAs的波動(dòng)，增加了血清甘油的水平，并且WAT和BAT中的NEFA水平和波動(dòng)嚴(yán)重降低（Fig. 7A），表明兩個(gè)脂肪庫中脂質(zhì)儲(chǔ)存的晝夜轉(zhuǎn)換受損。晝夜節(jié)律BAT中 NEFA的大量減少歸因于解偶聯(lián)蛋白-1（UCP1）激活直接刺激產(chǎn)熱質(zhì)子泄漏。在活化脂肪酸缺乏的情況下，線粒體外嘌呤核苷酸通過直接結(jié)合和抑制解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）來恢復(fù)BAT線粒體的能量守恒。同時(shí)5’-GMP（鳥苷一磷酸）及其前體鳥苷均在HFD上獲得了新的波動(dòng)，且在白晝期出現(xiàn)大幅增加并于ZT8達(dá)到峰值（Fig. 7B, 7C）。BAT含有高水平的GMP還原酶（GMPr），其催化鳥嘌呤核苷酸還原為肌苷一磷酸（IMP），從而通過釋放具有內(nèi)源性抑制性的核苷酸來促進(jìn)UCP1活化。IMP可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為AMP并去磷酸化形成腺苷，其是棕色脂肪細(xì)胞活化劑。與增加的5’-GMP一致，IMP, AMP和腺苷在來自HFD小鼠的BAT中均增加，隨著晝夜節(jié)律的變化而逐漸減少，這取決于它們與GMP的代謝鄰近（Fig. 7B, 7C）。
嘌呤核苷酸的細(xì)胞內(nèi)濃度常通過連續(xù)的相互轉(zhuǎn)化和分解代謝來維持（Fig. 7D）。在HFD組BAT中NAD+24小時(shí)波動(dòng)被消除，NAD+處于組成型低水平（Fig. 7E），表明HFD的BAT嘌呤核苷酸分解代謝受損。NAD+在線粒體和細(xì)胞核池中提供代謝調(diào)節(jié)。類似地，由SIRT3脫乙酰酶催化產(chǎn)生及又可通過煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）催化作為NAD+補(bǔ)救前體的煙酰胺（NAM）也在HFD組失去波動(dòng)（Fig. 7E）。HFD誘導(dǎo)的BAT時(shí)鐘功能減退可能直接損害Sirt3和Nampt基因表達(dá)，Nampt在白晝期表達(dá)適度降低，而Sirt3在黑暗期顯著增加。 HFD組BAT中24小時(shí)代謝物譜的變化反映了與時(shí)鐘中斷和錯(cuò)位有關(guān)的功能缺陷。為了研究GMP和IMP在驅(qū)動(dòng)質(zhì)子泄漏抑制中的作用，作者利用HEK293細(xì)胞（人胚胎腎細(xì)胞）分離出線粒體（可異位表達(dá)小鼠UCP1）。添加嘌呤GDP，GMP或IMP對(duì)正常HEK293細(xì)胞呼吸作用驅(qū)動(dòng)的質(zhì)子泄漏并沒有影響（Fig. 7G）。然而在UCP1存在時(shí)，質(zhì)子泄露動(dòng)力學(xué)向上移動(dòng)，顯示了解偶聯(lián)作用的增強(qiáng)，在添加GDP或GMP后，這種情況被阻止了。在最常見的膜電位下，添加GDP或GMP可引起含UCP-1線粒體產(chǎn)生相似的質(zhì)子傳導(dǎo)性降低，而添加IMP對(duì)呼吸速率或膜電位并沒有影響。這表明了鳥嘌呤部分對(duì)UCP-1抑制的重要性?？傊狙芯繑?shù)據(jù)表明HFD組BAT中GMP增加在生理上和嚴(yán)重受損的質(zhì)子泄露是相關(guān)的且可能是足夠的，特別是在HFD的脂肪酸水平大幅降低的情況下（Fig.7A）。 這將嚴(yán)重降低BAT對(duì)全身能量支出的貢獻(xiàn)，促進(jìn)脂質(zhì)的積累。
FIG.7 BAT中晝夜節(jié)律性脂質(zhì)波動(dòng)的喪失與嘌呤分解代謝減少，嘌呤核苷酸的重新波動(dòng)和UCP1激活受損有關(guān)
小結(jié)
代謝疾病通常以不同組織的晝夜失調(diào)為特征，本研究通過對(duì)Chow和 HFD喂養(yǎng)的小鼠八種不同組織進(jìn)行24小時(shí)代謝組學(xué)全譜分析，并繪制24小時(shí)內(nèi)代謝物的時(shí)間和空間分布圖，揭示了隨著時(shí)間的推移在各種組織內(nèi)和組織間代謝物的聯(lián)系及這些聯(lián)系如何被營養(yǎng)壓力（如高脂飲食）所改變，提出在全身能量平衡和慢性營養(yǎng)壓力（HFD）條件下如何在時(shí)間和空間上重建動(dòng)態(tài)代謝關(guān)系，突出了肌肉胰島素抵抗，肝臟脂肪變性，動(dòng)脈粥樣硬化和能量消耗減少之間的時(shí)間關(guān)系，以推動(dòng)代謝物分析超越簡單的診斷和生物標(biāo)記物檢測，轉(zhuǎn)向預(yù)防性醫(yī)學(xué)層面，更好地預(yù)測代謝物特征如何被控制以影響所需的代謝結(jié)果。
本研究還顯示了BAT代謝物脂質(zhì)波動(dòng)的喪失以及嘌呤核苷酸的重新波動(dòng)可能與UCP1功能相關(guān)（Fig. 7B）。白晝期NAD+波動(dòng)的喪失可說明嘌呤核苷酸降解受損，通過在該關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)期間增加GMP水平來促進(jìn)UCP1抑制。例如糖尿病患者紅細(xì)胞中觀察到GMP，IMP和AMP水平升高，血液嘌呤核苷酸升高是代謝疾病的常見病理生理結(jié)果。HFD中BAT的NAD+和NAM波動(dòng)的喪失可能是由于其形成過程中涉及的酶的晝夜節(jié)律破壞引起。關(guān)鍵的時(shí)鐘基因（Bmal1, Clock）和調(diào)節(jié)NAD+形成的BAT晝夜節(jié)律基因（Sirt3, Nampt）的表達(dá)被HFD改變，同時(shí)調(diào)節(jié)嘌呤核苷酸代謝（Impdh1和Gmpr）和產(chǎn)熱（Ucp1）基因的晝夜節(jié)律表達(dá)受到HFD的嚴(yán)重影響。 因此，BAT晝夜節(jié)律功能可能涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和代謝物之間的緊密協(xié)調(diào)。
總之，研究結(jié)果表明了不同飲食條件下代謝物隨著時(shí)間在各種組織內(nèi)和組織間出現(xiàn)代謝重建，不過，需要進(jìn)一步的研究來闡述亞細(xì)胞代謝物動(dòng)態(tài)變化，并監(jiān)測器官間代謝物通量。該研究為以后的動(dòng)物研究（何時(shí)處死，取何種組織等）以及臨床研究（營養(yǎng)干預(yù)方案、鍛煉方案、何時(shí)干預(yù)等）奠定了基礎(chǔ)。
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