高級別漿液性卵巢癌（HGSOC），起源于卵巢或輸卵管，是卵巢癌患者死亡的主要原因，所占比例較大，且死亡率居高不下，主要原因是由于晚期診斷和獲得性化療的耐藥性。因為卵巢和輸卵管隱藏在腹腔內(nèi)，所以80%罹患HGSOC的患者都是在癌細胞擴散后被診斷發(fā)現(xiàn)的。而目前的治療方式多以腫瘤切除手術(shù)和卡鉑/紫杉醇化療相結(jié)合為主，雖然是一種可以達到延長五個月的積極治療，但是80%的患者會遭遇腹內(nèi)復發(fā)，以至于后續(xù)會經(jīng)歷連續(xù)幾輪毫無治愈期望的化療。
但是，也有六分之一的患者在初步診斷為晚期癌擴散后仍然無疾病生存超過10年。目前為止，沒有已知的分子機制與這種延長的生存期相關(guān)聯(lián)，并且沒有良好的預測標記來區(qū)分這些患者與其他患有HGSOC的患者。因此，鑒定對化療有利的反應和某些患者的長期生存所依據(jù)的腫瘤內(nèi)在的易感特征對于疾病的預防與治療將是非常有用的。
雖然癌癥的主要研究集中在基因水平，但是蛋白質(zhì)作為執(zhí)行生物學功能的生物大分子，蛋白質(zhì)組學技術(shù)能夠?qū)毎到y(tǒng)進行非常深入,定量的分析，可以在蛋白水平上窺探疾病的發(fā)生機制。現(xiàn)有研究中，科學家通過大規(guī)模蛋白質(zhì)組學已將蛋白質(zhì)水平變化與基因水平變化相關(guān)聯(lián)，突出了如何將乙?；土姿峄卣髋c同源重組缺陷和生存率降低相關(guān)聯(lián)。
近日（2018年09月20日），來自馬克斯普朗克生物化學研究所的科學家運用定量蛋白組學、磷酸化蛋白組學技術(shù)，針對卡鉑耐藥和卡鉑敏感患者進行分析，探究高級別漿液性卵巢癌患者的長期生存驅(qū)動力。相關(guān)研究成果發(fā)表在國際專業(yè)學術(shù)期刊Cell上。
CT45作為晚期轉(zhuǎn)移性HGSOC化療后長期存活的標志物, 通過定量蛋白質(zhì)組學和功能驗證的結(jié)合，研究者發(fā)現(xiàn)CT45既可作為化學藥物敏感性的細胞內(nèi)在增強劑，也可以作為細胞毒性T細胞識別的非突變腫瘤抗原。預測CT45的表達將改善晚期卵巢癌患者的鉑類化療或免疫療法的療效。這項研究闡述了臨床癌癥蛋白質(zhì)組學鑒定化學和免疫療法靶點的能力，并闡明了它們的生物學作用。
1. 定量蛋白質(zhì)組學分析，揭示癌癥睪丸抗原CT45與疾病顯著相關(guān)
研究者采集了25名未接受化療的晚期HGSOC患者的FFPE腫瘤樣本，使用Label-Free定量技術(shù)，進行蛋白質(zhì)組學定量分析。
圖1. 卵巢癌患者的FFPE腫瘤的蛋白質(zhì)組學實驗流程
研究發(fā)現(xiàn)患者組的總體蛋白質(zhì)組變化很少（如所有腫瘤蛋白質(zhì)組的主成分分析（PCA）所示，圖2左）。然而，在化學藥物敏感和化學藥物耐藥患者的比較中，發(fā)現(xiàn)CT45在化學藥物敏感患者中表達顯著(圖2右)。CT45表達高的患者與無CT45表達的患者相比，無病生存期得到延長。
圖2. 通過PCA對化療耐藥和敏感的腫瘤蛋白質(zhì)組進行分組(左); 化療耐藥與敏感性腫瘤蛋白質(zhì)組的火山圖(右),
圖3. 通過HGSOC TMA的CT45染色進行無病生存Kaplan-Meier分析。
比較染色評分為0（n = 82）與1+（n = 42）的晚期HGSOC患者。
2. 磷酸化蛋白質(zhì)組學揭示了CT45在化學敏感性中的作用
過去研究表明，卡鉑治療誘導了DNA鏈間交聯(lián)，其可通過Fanconi貧血（FA）信號傳導途徑被感知和修復。 作者為了驗證FA信號傳導是否被激活，在CT45和用卡鉑處理的載體對照組OVCAR-5細胞上應用磷酸蛋白質(zhì)組學分析。
分析顯示DNA損傷信號通路被強烈激活， 其中包括FA信號通路， 與對照載體細胞相比，在用卡鉑處理的CT45表達細胞中DNA損傷相關(guān)信號通路過度活化。
圖四。 OVCAR-5細胞系對±5mM卡鉑處理的磷酸化蛋白質(zhì)組學分析，差異調(diào)節(jié)的途徑被繪制為熱圖。
相對富集分數(shù)表明樣品上調(diào)（黃色）和下調(diào)（黑色）途徑
3. 互作蛋白組學闡明CT45在DNA損傷信號通路中的介入
為了進一步了解CT45-介導的化學藥物敏感性，作者利用定量互作蛋白組學分析,發(fā)現(xiàn)CT45與進化保守的蛋白質(zhì)磷酸酶4（PP4）復合物的相互作用 (圖5).
圖5. 通過OVCAR-5細胞中的互作蛋白質(zhì)組學篩選穩(wěn)定過表達FLAG標記的CT45
此外，通過ITC測量和對在有無3mM重組GST-CT45或GST-CDC20對照蛋白的情況下免疫純化的PP4復合物的磷酸酶活性測定，證實重組CT45在體外降低了PP4磷酸酶活性，而在等摩爾濃度下未觀察到非結(jié)合對照蛋白的抑制作用。這些數(shù)據(jù)表明了CT45可充當PP4信號傳導的新型內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑。
圖6. ITC測量PP4R3b與GST-CDC20的結(jié)合(圖上左); 在有無3mM重組GST-CT45或GST-CDC20對照蛋白的情況下免疫純化的PP4復合物的磷酸酶活性測定, 定量結(jié)果（圖上右）代表五次獨立實驗的平均值與蛋白印跡結(jié)果（圖下左右）顯示為上樣對照;
接下來作者假設(shè)如果CT45降低了PP4活性，CT45表達應該在全磷酸化蛋白質(zhì)組水平上可以部分模擬PP4C敲除實驗。于是,作者利用磷酸化蛋白質(zhì)組學分析利用siRNA; siCTRL，CT45靶向siRNA（siCT45）或PP4C靶向siRNA（siPP4C）進行轉(zhuǎn)染的59M細胞.
圖7. 59M細胞的蛋白印跡結(jié)果用于驗證磷酸化蛋白質(zhì)組學分析(左上); 在每個樣品組中鑒定I類磷酸化位點的數(shù)量(左下); 所有磷酸化位點的強度分布(右)
此外, 聚類分析揭示了CT45表達和PP4C敲除細胞簇功能富集與DDR信號傳導相關(guān)的磷酸化位點。其中包括在S473處的KAP1的磷酸化，S473是已知的PP4調(diào)節(jié)位點，對于DNA損傷的細胞周期檢查點控制是重要的(圖6下左)。 CT45敲除的細胞中該磷酸化位點的強度最低，表明PP4活性高于siPP4C和siCTRL（表達CT45）細胞。 對CT45染色質(zhì)互作組的分析證實，PP4及其底物KAP1均與CT45定位于相同的染色質(zhì)環(huán)境，以及其他強烈富集的DNA損傷和修復蛋白(圖6下右). 以上數(shù)據(jù)顯示CT45直接抑制了PP4活性并揭示卵巢癌患者中CT45表達，化學藥物敏感性和PP4活性之間的聯(lián)系。
圖8. 利用CT45（siCT45），PP4C（siPP4C）或?qū)φ眨╯iCRTL）siRNA敲除59M細胞±4mM卡鉑處理72小時的磷酸化蛋白質(zhì)組學分析
(上左圖：基于所有磷酸化蛋白質(zhì)組的主成分分析的樣品組; 上右圖: 沿組分2上調(diào)磷酸鹽的蛋白路徑富集分析);
PP4靶點的KAP1-S473磷酸化位點強度(下圖左);
V5標簽的OVCAR5-V5-CT45對比OVCAR5-V5細胞系中染色質(zhì) - 免疫沉淀質(zhì)譜（ChIP-MS）火山圖(下圖右)
4. 免疫肽段組學證實CT45作為原發(fā)腫瘤抗原可以被DNA甲基化調(diào)控
由于CT45的高腫瘤特異性和免疫原性被認為是前景的免疫治療靶點, 而后作者探究了免疫應答在CT45表達的患者長期存活中是否可能發(fā)揮作用。理想的免疫治療靶標應在癌組織中高表達，而不在正常，健康的組織中表達。分析了37種正常組織的公共RNA-seq數(shù)據(jù)集后發(fā)現(xiàn)CT45僅在睪丸中表達, 證實了CT45是一個經(jīng)典的癌癥睪丸抗原(CTA). 之后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過DAC處理的SKOV3ip1卵巢癌細胞的蛋白質(zhì)組學分析顯示，CT45與CTAs NY-ESO-1，MAGEA4和SSX2一起位于前十大上調(diào)蛋白中 (圖7)。
圖9. DAC治療組和對照組SKOV3ip1卵巢癌細胞之間蛋白質(zhì)組學比較的火山圖
5. CT45肽段激活了癌患者體內(nèi)的毒性T細胞
作者通過Ki-67和細胞內(nèi)干擾素g（IFNg）染色評估，發(fā)現(xiàn)CT45肽（而非對照肽）均誘導CD8 + T細胞活化。
圖10 . 流式細胞分析(利用兩種CT45肽段（AVDPETVFK和GVQGPTAVRK）或一種HIV陰性對照肽段刺激后, 對A-11：01 CD8 + T細胞的細胞內(nèi)IFN-γ和Ki-67細胞染色)
本文作者為了探究高級別漿液性卵巢癌患者的長期生存驅(qū)動力,進行了卡鉑耐藥和卡鉑敏感患者的定量蛋白組學分析。研究發(fā)現(xiàn)癌癥睪丸抗原CT45作為一個獨立預后因素，與癌癥晚期患者無病生存率增加一倍相關(guān)。
磷酸化蛋白組學與蛋白互作組學分析發(fā)現(xiàn)CT45與DNA損傷通路的關(guān)聯(lián)性，并與PP4磷酸酶復合物可直接作用。體外實驗證明了CT45調(diào)控了 PP4活性, 利用CT45的表達上調(diào)增加了DNA損傷水平與對卡鉑的敏感性。
隨后，研究者用免疫肽段組學實驗證實了源自CT45的HLA class l肽段, 激活了患者體內(nèi)毒性T細胞, 促進了對腫瘤細胞的吞噬. 這項研究闡述了臨床癌癥蛋白質(zhì)組學鑒定化學和免疫療法靶點的能力，并闡明了它們的生物學作用。
這項研究闡述了臨床腫瘤蛋白質(zhì)組學鑒定化學和免疫療法靶點的能力，并闡明了它們的生物學作用。
參考文獻：
Coscia, et al. (2018), Multi-level Proteomics Identifies CT45 as a Chemosensitivity Mediator and Immunotherapy Target in Ovarian Cancer. Cell. 175, 159–170.
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