IFCC參考方法在五種糖化血紅蛋白檢測系統(tǒng)評價中的應(yīng)用
日期：2019-05-08
糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)是糖尿病管理的重要指標。2011年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)發(fā)布報告，推薦在有條件的地區(qū)采用HbA1c診斷糖尿病[1]。HbA1c實驗室測定結(jié)果準確可比，實現(xiàn)檢測的標準化，是HbA1c臨床應(yīng)用的重要前提和保障。經(jīng)過多年努力，國內(nèi)外糖化血紅蛋白的標準化工作已取得較大進展[2,3,4]。我國目前已建立了完整的HbA1c參考系統(tǒng)，包括國際臨床化學與檢驗醫(yī)學聯(lián)合會(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC)發(fā)布的糖化血紅蛋白一級參考測量程序[5,6]，國家一級標準物質(zhì)和數(shù)個參考實驗室[7]。充分利用參考系統(tǒng)，提高檢測質(zhì)量，是糖化血紅蛋白標準化的重要工作內(nèi)容之一。
方法學評價是研究和評價檢測方法性能的常用手段。以往受條件限制，臨床實驗室多采用已獲得臨床驗證的常規(guī)方法或者自選方法作為參比方法，所得數(shù)據(jù)存在一定的局限性。參考方法是方法學評價首選的參比方法。本研究以IFCC糖化血紅蛋白參考方法為參比方法，對臨床上常用的4種離子交換高效液相色譜法檢測系統(tǒng)和1種毛細管電泳檢測系統(tǒng)的正確度進行考察，以及精密度、線性和分析干擾的評價，為參考方法在糖化血紅蛋白檢測系統(tǒng)的方法學評價研究中的應(yīng)用提供實例。
材料與方法
一、材料
1．溶血液樣本：
收集北京醫(yī)院檢驗科和內(nèi)分泌科、北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科2017年9至10月表觀正常體檢者及糖尿病患者檢測后剩余的乙二胺四乙酸二鉀(Dipotassium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate，EDTA-2K)抗凝外周血若干，剔除外觀明顯黃疸、脂血和乳糜等異常樣本，置于4 ℃保存。挑選濃度范圍均勻分布在22 mmol/mol～147 mmol/mol(4.2%～15.6%，National GlycohemoglobinStandardization Program，美國國家糖化血紅蛋白標準化計劃，NGSP單位)的樣本于48 h內(nèi)按照IFCC參考方法標準操作程序[5]制成單人溶血液樣本40份，分裝后－80℃保存，用于正確度考察。本研究樣本收集經(jīng)北京醫(yī)院倫理委員會批準豁免簽署受試者知情同意書(倫理審查批件號2016BJYYEC-121-02)。
2．全血樣本：
按上述程序收集北京醫(yī)院檢驗科和內(nèi)分泌科、北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科2018年4至6月表觀正常體檢者及糖尿病患者剩余EDTA抗凝外周血若干，樣本濃度范圍為20 mmol/mol～143 mmol/mol(4.0%～15.3%，NGSP單位)，置－80 ℃保存。使用前，室溫放置30 min充分融化后按照研究方案制成各種混合全血樣本用于精密度、線性及分析干擾研究(見下文"方法學評價")。
3．儀器和試劑：
5個糖化血紅蛋白檢測系統(tǒng)分別為(按中文名稱拼音排序)：愛科來(Arkray,日本)ADAMS? HA-8180分析儀及其配套試劑和校準品(試劑批號：8A1321)，離子交換高效液相色譜法(簡稱8180)；伯樂(Bio-Rad，美國)Variant? Ⅱ分析儀及其配套試劑和校準品(試劑批號：64093321/64093322/64139366)，離子交換高效液相色譜法(簡稱VariantⅡ)；東曹(TOSOH，日本)HLC-723 G8分析儀及其配套試劑和校準品(試劑批號：K8-201D/8-303C)，離子交換高效液相色譜法(簡稱G8)；上?；葜?/span>MQ-6000分析儀及其配套試劑和校準品(試劑批號：20180510E)，離子交換高效液相色譜法(簡稱6000)；Sebia(法國)Capillarys 2 Flex-Piercing分析儀及其配套試劑和校準品(試劑批號：6067180)，毛細管電泳法(簡稱Capillarys2)。
IFCC參考方法使用的主要分析儀器為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(liquid chromatography-tandemmass spectrometry，LC-MS/MS)，包括高效液相色譜儀Agilent 1200(Agilent，美國)、串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀API 5000和Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件(Applied Biosystems，美國)以及配有餾分收集器(型號G1364C)和紫外檢測器的高效液相色譜儀Agilent 1200(Agilent，美國)。校準品為IFCC糖化血紅蛋白參考實驗室網(wǎng)絡(luò)指定一級參考物質(zhì)pcal-2014，包括6個水平，濃度范圍為0～160mmol/mol。蛋白內(nèi)切酶(endoproteinase Glu-C)購自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司(Roche，瑞士)，用去離子水配制為200μg/ml溶液。用于正確度質(zhì)控的糖化血紅蛋白國家一級標準物質(zhì)GBW09181a、09182a和09183a來自北京醫(yī)院。
二、IFCC參考方法測定
1．酶切：
取20 μl溶血液樣本或30 μl校準品于2 ml樣品瓶中，加入50 μl內(nèi)切酶溶液及420 μl乙酸銨緩沖液(50 mmol/L，pH 4.3)，混勻密封后置于37 ℃(±0.5 ℃)溫育18～20 h。取出置于－20 ℃及以下停止酶切反應(yīng)。使用前從冰箱取出，室溫放置15 min后進行多肽純化。
2．多肽純化：
純化過程使用的色譜柱為Zorbax XDB C18柱(4.6 mm×150 mm，粒徑5 μm，Agilent，美國)。流動相A液為水(含0.05%三氟乙酸)，B液為乙腈(含0.05%三氟乙酸)，洗脫梯度為B液在5 min內(nèi)由12%增加至30%，其后在0.1 min內(nèi)變化至100%并保持1 min。最后在0.1min內(nèi)返回至12%，在3.8 min后達到平衡。整個梯度洗脫循環(huán)總計10 min。每個樣本進樣25 μl,采集波長為214 nm，使用餾分收集器收集3.9 min至4.5 min的組分，加入等體積的去離子水供LC-MS/MS測定。
3．LC-MS/MS測定：
使用色譜柱為Sunfire? C18柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm，Waters，美國)，流動相水(含0.1%甲酸)：乙腈(88∶12)，流速為0.2 ml/min，進樣體積為1 μl。質(zhì)譜分析采用電噴霧電離源，正離子分析模式，多反應(yīng)監(jiān)測掃描方式，監(jiān)測的離子轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>m/z 348.3→245.1(非糖化β鏈N-末端六肽)和m/z 429.4→245.1(糖化β鏈N-末端六肽)。噴霧氣、霧化輔助加熱氣、氣簾氣和碰撞氣均為氮氣，分別為60 psi、70 psi、25 psi和6 psi，霧化輔助加熱氣加熱溫度為500 ℃。去簇電壓、入口電壓和噴霧電壓分別為30 V、6 V和5 500 V。出口電壓和碰撞能量對離子轉(zhuǎn)變m/z 348.3→245.18 V和35V，對m/z 429.4→245.1為11 V和36 V。
4．分析過程：
將校準品和樣本隨機穿插，以正序和逆序重復(fù)測定2次。以兩次進樣所得數(shù)據(jù)的均值為測定結(jié)果。
5．數(shù)據(jù)處理：
以校準品糖化六肽和非糖化六肽的峰面積比(rsig)對濃度比(rconc)做回歸曲線得到校準方程，由此計算得到待測樣本的rconc，按照下式計算糖化血紅蛋白水平(Zconc，mmol/mol)。NGSP單位結(jié)果由主方程NGSP＝0.091 48 IFCC ＋2.152換算得到。
三、方法學評價
1．正確度：
將溶血樣本從冰箱中取出，室溫放置15 min融化，充分混勻。參照美國臨床和實驗室標準研究所(Clinical andLaboratory Standards Institute，CLSI)EP9-A3的評價方案，使用5個HbA1c檢測系統(tǒng)，以手工模式對40份溶血液樣本進行預(yù)稀釋后測定，稀釋劑及稀釋比例按照各系統(tǒng)推薦的程序操作。每個樣本重復(fù)測定3次，將所得數(shù)據(jù)的均值作為測定結(jié)果。用廣義極端學生化偏差(extremestudentized deviate，ESD)方法檢驗離群值點。以IFCC參考方法比對參比方法，繪制偏差圖進行初步偏倚評估，使用普通線性回歸(ordinarylinear regression，OLR)模型作回歸分析。計算兩個醫(yī)學決定水平6.5%(48 mmol/mol，美國糖尿病學會推薦的糖尿病診斷標準)、7.0%(53 mmol/mol，美國糖尿病學會推薦的糖尿病患者控制標準)處的預(yù)期偏移。
2．精密度：
按照行業(yè)標準《WS/T 492-2016臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》的評價方案，制備高低兩個水平的混合冰凍全血樣本，在各系統(tǒng)上以自動稀釋模式測定樣本。每天分析一批，每個水平同一樣品重復(fù)測定3次，連續(xù)測定5 d，計算實驗室內(nèi)精密度變異系數(shù)(coefficient of variance，CV)。
3．線性：
依據(jù)CLSI EP6-A文件的評估方案，選取低值(20 mmol/mol，4.0 %HbA1c)和高值(144 mmol/mol，15.3%HbA1c)全血樣本各1份，按照一定比例將兩者稀釋混合，得到7個不同濃度的樣本，在各系統(tǒng)上以手工模式稀釋樣本后進行測定，每個濃度水平測定2次，將所得數(shù)據(jù)的均值作為測定結(jié)果。以理論糖化血紅蛋白濃度(根據(jù)高值、低值樣本的糖化血紅蛋白濃度和稀釋比例分別計算)為自變量，測定結(jié)果為因變量進行多項式線性評價。
4．分析干擾：
依據(jù)CLSI EP7-A2文件的方案，制備HbA1c濃度約為31 mmol/mol和69 mmol/mol(5%和8.5%)EDTA-全血2份作為基礎(chǔ)樣本，分別加入下述干擾物質(zhì)，每種干擾物質(zhì)添加5種不同濃度，包括結(jié)合溶血血紅蛋白(1 000 mg/dl～5 000 mg/dl)、乳糜(100 FTU～1 400 FTU)、膽紅素(1 mg/dl～18 mg/dl)、阿司匹林(10 mg/L～160 mg/L)和維生素C(2.5 mg/dl～50 mg/dl)。另制備添加不同濃度葡萄糖(5 mmol/L～250 mmol/L)的樣本，于37 ℃水浴孵育3 h后取出置于－20 ℃保存?zhèn)溆?。?/span>5個系統(tǒng)上以手工模式稀釋樣本后進行測定各個干擾樣本，每種每個濃度水平測定2次，將所得數(shù)據(jù)的均值作為測定結(jié)果。
5．統(tǒng)計學分析：
用Microsoft Excel 2010軟件對正確度、精密度、線性和分析干擾的實驗結(jié)果進行統(tǒng)計。
結(jié)果
一、IFCC參考方法測定結(jié)果
40個溶血液樣本分為4批測定，每批20個樣本，每個樣本重復(fù)測定兩批。每批測定同時測定國家一級標準物質(zhì)GBW 09181a、09182a或09183a作為正確度質(zhì)控。40個樣本重復(fù)測定的平均CV為1.4%(范圍0.2%～2.5%)。4個批次正確度質(zhì)控品與靶值的相對偏倚為－1.6%～ 0.13%，均包含在所用標準物質(zhì)的擴展相對不確定度(k＝2)范圍內(nèi)。
二、方法學評價結(jié)果
1．正確度：
對5個HbA1c系統(tǒng)40份溶血液樣本的測定結(jié)果用ESD方法檢驗，未發(fā)現(xiàn)離群值。8180、VariantⅡ、G8、6000和Capillarys 2的最大偏移(ESD1)依次分別為2.57、3.04、2.47、2.78和2.41，臨界值
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