● 期刊：Hepatology
● IF=14.971
● 發(fā)表時間：2019-08-23
實驗內(nèi)容
靶向膽汁酸檢測、16s RNA、生理生化檢測及qPCR
研究思路
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)影響大約20%到30%的世界人口，是導(dǎo)致終末期肝病、癌癥的主要原因。盡管如此，被稱為“瘦非酒精性脂肪肝”或“瘦患者非酒精性脂肪肝”實體的存在和臨床進程一直是激烈辯論和爭議的主題?！笆莘蔷凭灾拘愿尾 敝傅氖窃谡ｓw重指數(shù)(BMI)的情況下表現(xiàn)出疾病。越來越多的證據(jù)表明，瘦型非酒精性脂肪性肝病可能是一種獨特的病理生理學(xué)實體，其中大約一半(47%-65%)患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。瘦型非酒精性脂肪性肝病的自然史特征更不明顯，與肥胖的非酒精性脂肪性肝病相比，其發(fā)病機理和機制令人困惑且了解不多，瘦型非酒精性脂肪性肝病的治療方案仍未確定。
對于代謝體內(nèi)平衡，除了神經(jīng)內(nèi)分泌軸、熱量攝入和體力活動外，腸肝循環(huán)，包括膽汁酸(BAs)及其代謝物和腸道微生物群也密切相關(guān)。膽汁酸是膽固醇分解代謝的主要途徑，最近的證據(jù)表明，膳食膽固醇的高攝入、肝膽固醇水平的升高和肝膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞是非酒精性脂肪肝的關(guān)鍵驅(qū)動因素。有研究表明，與肥胖的非酒精性脂肪肝相比，瘦型的膽固醇攝入量更高。膽汁酸還調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝以及能量消耗，而它們的生產(chǎn)、運輸和代謝又由特定的核膽汁酸受體FXR和FGF19調(diào)節(jié)，這可能是通過依賴和獨立的機制實現(xiàn)的。腸道微生物群也與多種代謝疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)，包括體重調(diào)節(jié)、非酒精性脂肪肝和肝癌，部分是通過與膽汁酸的直接作用。
本研究針對臨床瘦型、肥胖型非酒精性脂肪肝患者和瘦型正常人以及動物模型的研究，證實了腸道菌群及膽汁酸在不同類型的非酒精性脂肪肝中的差異及作用。
研究結(jié)果
1.瘦型NAFLD的臨床和遺傳學(xué)特征
本研究共招募了538例經(jīng)活檢證實為NAFLD的患者，有99人(18%)是瘦人。除了低BMI,相較于非瘦型患者，瘦型患者有更低的腰臀比(WHR)和更良好的代謝狀況,包括糖尿病頻率、高血清高密度脂蛋白(HDL)、血清甘油三酯、空腹血糖和內(nèi)穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗(HOMA-IR)值等。組織學(xué)上，瘦患者的纖維化評分和NAFLD活性評分較低，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)較低?？偟膩碚f，與非瘦性NAFLD相比，瘦性NAFLD具有良好的代謝和組織學(xué)特征。
瘦型非酒精性脂肪肝患者攜帶TM6SF2 rs58542926 (T)等位基因的患病率明顯高于非瘦型患者，但PNPLA3 GG多態(tài)性的患病率相似。在一個多變量模型中，矯正年齡、性別、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、糖尿病、總膽固醇水平、纖維化、脂肪變性和PNPLA3基因型因素，但TM6SF2 rs58542926 (T)等位基因仍然與瘦型NAFLD相關(guān)。
2. 血清膽汁酸與NAFLD的嚴重程度有關(guān)
膽汁酸與NAFLD纖維化分期的關(guān)系。所有膽汁酸在無/輕度纖維化和明顯纖維化患者之間的分布如圖1A所示。顯著纖維化(≥F2)患者的總膽汁酸水平、初級膽汁酸水平和次級膽汁酸水平均高于無/輕度纖維化(F0-F1)患者(圖1B)。在個體膽汁酸水平上，顯著纖維化患者的膽汁酸水平明顯高于無/輕度纖維化患者(圖1C)。同樣，顯著纖維化患者的甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合態(tài)膽汁酸水平顯著高于無/輕度纖維化患者(圖1D,E)。膽汁酸水平和纖維化之間的關(guān)系仍然是通過多變量線性回歸分析矯正年齡、BMI、性別、糖尿病、ALT和血小板等因素。
圖1
3.瘦NAFLD患者血清膽汁酸水平較高
接下來，探討瘦型和非瘦型NAFLD患者膽汁酸的差異。有趣的是，與非瘦NAFLD患者相比，瘦型NAFLD患者的總膽汁酸、初級性和次級性膽汁酸水平更高，其中次級膽汁酸呈顯著差異(圖2B)。瘦型NAFLD患者與非瘦型NAFLD患者個體的膽汁酸組成也存在差異，其中瘦患者的脫氧膽酸(DCA)、糖基脫氧膽酸(GCDCA)、糖基脫氧膽酸(CDCA)較低，而糖基膽酸(GCA)較非瘦患者較多(圖2A)。與非瘦型NAFLD患者相比，瘦型NAFLD患者的總結(jié)合態(tài)膽汁酸和總非結(jié)合態(tài)膽汁酸均無顯著性升高。
鑒于膽汁酸譜與纖維化的相關(guān)性強，還研究了纖維化分期、膽汁酸與瘦型NAFLD的關(guān)系。當以這種方式分析時，在輕度纖維化(F0-F1)患者中，與非瘦性NAFLD患者相比，瘦性NAFLD患者的總次級膽汁酸水平更高。在纖維化程度較重的患者中，瘦型和非瘦型患者無顯著差異(圖2C,D)。造成這種差異的主要是次級膽汁酸為DCA和UDCA(圖2E,F)。
在隨后的分析中，確定了與次級膽汁酸水平相關(guān)的臨床因素。一致地，在單變量分析中，BMI、纖維化和腫脹與次級膽汁酸水平相關(guān)。在多變量分析中，只有BMI和纖維化階段獨立地與次級膽汁酸水平呈負相關(guān)和正相關(guān)。
圖2
4.瘦型NAFLD患者血清FGF19水平較高
FXR失調(diào)與NAFLD的發(fā)病機制有關(guān)；因此，作者需要確定瘦型NAFLD和非瘦型NAFLD是否存在差異效應(yīng)。為了檢驗這一點，測定了FXR活性的替代標記血清FGF19。在本分析中，F(xiàn)GF19水平隨著纖維化程度的進展而降低(圖3A)。瘦型NAFLD患者的FGF19水平明顯高于非瘦型NAFLD患者(圖3B)。有趣的是，當按纖維化嚴重程度分類時，輕度纖維化(F0-F1)的差異更大，隨著纖維化嚴重程度的增加，反之亦然；然而，這并不顯著(圖3C)。
圖3
5.瘦型NAFLD患者C4（7-alpha-hydroxy-4-cholesten-3-one）水平較低
為了研究瘦型和非瘦型NAFLD中膽汁酸代謝的差異，測定了膽汁酸合成中間體C4的含量，作為從頭合成膽汁酸的標志。本分析中，根據(jù)纖維化分期，C4水平無差異(圖3D)。然而，正如預(yù)期的那樣，與非瘦型NAFLD患者相比，瘦型NAFLD患者的C4水平顯著降低(圖3E)。這種差異在輕度纖維化(F0-F1)患者中更為明顯，而在中度/重度纖維化(F2-F4)患者中則不明顯(圖3F)。瘦型NAFLD患者有獨特的微生物群分布。
腸道微生物群的組成及其與膽汁酸的相互作用影響著FXR介導(dǎo)的肝臟和腸道信號通路，并與NAFLD的發(fā)病機制有關(guān)。在門水平上，根據(jù)瘦與肥胖的BMI狀況，腸道微生物組的分類組成沒有差異。在屬水平上，Erysipelotrichaceae UCG-003以及梭菌目中的幾個細菌屬，包括Ruminococcus, Clostridium sensu stricto 1, Romboutsia, 以及Ruminococcaceae UCG-008，這些菌群在瘦型患者中豐度較高，而Ruminiclostridium和Streptococcus在肥胖型患者中豐度較高（圖4）。
圖4
6.與瘦型健康人相比，瘦型NAFLD患者有不同的膽汁酸譜和微生物群分布
與瘦型健康人相比，瘦型NAFLD患者的總膽汁酸、初級膽汁酸和次級膽汁酸均顯著升高。瘦型健康人與無/輕度纖維化的瘦型NAFLD患者FGF19水平無顯著差異(F0-F1)。然而，在中度/重度纖維化(F2-F4)的瘦型NAFLD患者中，F(xiàn)GF19水平明顯低于瘦型健康人。對微生物群的分析表明，瘦型健康人和瘦型NAFLD有很大差別，瘦型NAFLD患者Dorea的豐度增加，而Marvinbryantia 和 Christensellenaceae R7豐度降低。
7.小鼠瘦型NAFLD模型膽汁酸含量增加，腸道菌群發(fā)生改變
為了進一步驗證假設(shè)，研究了瘦型和非瘦型NAFLD小鼠模型中膽汁酸水平和腸道微生物群的變化。小鼠被喂食高膽固醇(ChR)或高蔗糖食物16周。與之前的研究一致，喂食ChR飼料的小鼠盡管發(fā)生NAFLD，但仍然保持瘦的體型，而喂食高蔗糖飼料的小鼠體重顯著增加。組織學(xué)圖像如圖5A所示。與我們的人類實驗結(jié)果一樣，喂食ChR飼料的小鼠的總膽汁酸、初級膽汁酸和次級膽汁酸均顯著升高(圖5B)。回腸fgf15(與人類FGF19相當)的分析顯示，與高蔗糖飲食相比，喂食ChR的小鼠回腸fgf15的水平顯著升高(圖5C)。
對微生物群落的分析表明，組成發(fā)生了變化，這廣泛反映在兩個主要門——厚壁菌門和擬桿菌門，以及放線菌門、藍細菌門和變形菌門——相對豐度的顯著變化上。與高蔗糖喂養(yǎng)的小鼠相比，ChR喂養(yǎng)的小鼠的擬桿菌門相對豐度增加，厚壁菌門減少(圖5D)。人類身上同樣的趨勢也被注意到，在喂食高膽固醇飲食(瘦型NAFLD)的小鼠中，乳球菌科的數(shù)量豐富。
圖5
8.在瘦非酒精性脂肪性肝病模型中，抑制膽汁酸再吸收可改善脂肪性肝炎
最后，為了研究本結(jié)果的治療意義，對ChR日糧喂養(yǎng)的小鼠(瘦型NAFLD)進行了添加或不添加膽汁酸轉(zhuǎn)運抑制劑(ASBTi) (SC-435)的治療，該抑制劑介導(dǎo)膽汁酸主動重吸收進入腸肝循環(huán)。補充SC-435可降低肝臟/體重比、肝臟總膽固醇和游離膽固醇積累，但不影響身體或附睪重量。組織學(xué)上，SC-435治療降低了炎癥和纖維化，降低了非酒精性脂肪肝活性評分（NAS） (圖6B)和血清ALT水平(圖6C)。與預(yù)期一樣，炎癥和纖維化標志物的信使RNA (mRNA)表達降低(圖6D)。在進一步的分析中，SC-435治療導(dǎo)致膽汁酸譜發(fā)生改變，F(xiàn)XR激動劑膽汁酸(如DCA和TDCA)升高 (圖6E)，回腸fgf15水平升高，參與調(diào)控膽汁酸的視黃質(zhì)X受體(RXR)、FXR等在肝臟中的mRNA表達上升(圖6E)。有趣的是，與對照小鼠相比，喂食SC-435增加了小鼠的盲腸重量并改變了腸道微生物群，增加了類桿菌的相對豐度，并降低了拉克氏菌科的相對豐度(圖6F)。
圖6
最后如下圖所示，展示了瘦型和肥胖型NAFLD患者的病理生理學(xué)差異模型。瘦患者具有較好的代謝和肝臟組織學(xué)特征。瘦患者對導(dǎo)致體重增加的環(huán)境有適當?shù)拇x適應(yīng)，這與瘦患者對肥胖有抵抗能力的觀點是一致的。補償性機制包括膽汁酸和FXR活性的增加，以及獨特的腸道微生物群分布，這些解釋了脂肪變性發(fā)展過程中有利的分布。在瘦型和肥胖型NAFLD小鼠模型中也觀察到類似的特征。
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