靶向代謝組學(xué)屬于代謝組學(xué)的一個分支，代謝組學(xué)和基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等共同組成系統(tǒng)生物學(xué)大家庭，如下圖：
從代謝組學(xué)的角度，靶向代謝組開發(fā)是基于廣靶分析的再次驗證，也就是對生物機(jī)體中廣泛篩查后的物質(zhì)成分，給出準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果。主要針對生物機(jī)體中分子量小于1000的特定物質(zhì)或特定類型的成分，包含機(jī)體各種代謝途徑下的中間產(chǎn)物、底物和或相關(guān)標(biāo)志物，比較常見的類型如氨基酸、核苷酸、糖類、脂肪酸、膽汁酸、氧化脂質(zhì)等等。
靶向代謝組方法開發(fā)常用的有絕對定量和相對定量，其區(qū)別在于絕對定量需配制不同梯度的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出準(zhǔn)確的含量，而相對定量則無需提供標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算準(zhǔn)確含量，僅提供目標(biāo)成分的響應(yīng)即可。
如何建立科學(xué)的靶向代謝組學(xué)分析方法？
一般而言，完整的靶向方法開發(fā)包含文獻(xiàn)調(diào)研，樣品前處理開發(fā)，儀器方法開發(fā)，方法學(xué)驗證等環(huán)節(jié)。
下面以基于質(zhì)譜分析建立靶向代謝方法學(xué)開發(fā)進(jìn)行說明。
文獻(xiàn)調(diào)研
查閱國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊，分析樣品處理方法、檢測方法、定量限等，核心的目標(biāo)是確定方法開發(fā)的可行性并給出實驗方案。后續(xù)的開發(fā)過程，都基于文獻(xiàn)調(diào)研的結(jié)果。
首先確定樣本的類型和待分析物的類別。每種類別都有各自的理化性質(zhì)和特點。
其次，文獻(xiàn)查詢的關(guān)鍵詞要準(zhǔn)確規(guī)范，目的就是為了保證文獻(xiàn)查詢的精準(zhǔn)、全面。文獻(xiàn)搜索的范圍，包括中英文期刊論文、國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、相關(guān)專利等。如下圖顯示的是常用的幾個搜索工具或數(shù)據(jù)庫：
圖1 知網(wǎng)查詢
圖2 SCI-HUB查詢
圖3 PubMed查詢
圖4 國家標(biāo)準(zhǔn)查詢
除此之外，還有百度學(xué)術(shù)，谷歌學(xué)術(shù)，Web of science，chemspider，pubchem等網(wǎng)上資源，相關(guān)的文獻(xiàn)資料也很多。
文獻(xiàn)篩選也需要考慮其權(quán)威性，同時關(guān)注相關(guān)領(lǐng)域最權(quán)威的實驗室和最新的研究文章。
樣品前處理開發(fā)
由于生物樣品的基質(zhì)復(fù)雜，待分析物的含量較低（一般為ng/L或μg/L）,因此對方法的靈敏度和精密度有著更高的要求，那么樣品前處理就顯得尤為重要。通常，前處理優(yōu)化包含取樣量、提取溶劑、提取方式、樣品凈化或濃縮等。
取樣量根據(jù)樣本特性選擇，也根據(jù)待分析目標(biāo)確定，血漿、組織、細(xì)胞、尿液等都有常規(guī)的取樣原則。
提取溶劑的選擇主要依據(jù)物質(zhì)的理化信息，可以綜合各種文獻(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，同時需要明確并注意的是樣品提取環(huán)節(jié)，是否需要避光？是否需要低溫環(huán)境？是否需要增加穩(wěn)定劑（如抗氧化、調(diào)節(jié)酸堿度）？等等。
如果目標(biāo)物在樣品含量極低，或目標(biāo)物受基質(zhì)干擾較大，需要考慮樣品的富集或純化，常見的方法如溶劑萃取、過固相萃取小柱、大孔樹脂純化、脫脂處理等，具體方案依照文獻(xiàn)查詢的結(jié)果綜合考慮。
有時為了提高待分析物的可檢測性，可考慮衍生化處理。如用GC-MS方法開發(fā)糖類成分、脂肪酸類成分時，就需要考慮采用衍生化試劑處理。
樣品前處理方案，是要在保證提取完全的基礎(chǔ)上，避免目標(biāo)物的降解、轉(zhuǎn)化，降低基質(zhì)干擾，以提高方法的靈敏度。但對于大批量樣品的分析，前處理方法還需要考慮過程的簡單，避免過多的試劑和提取過程引入的誤差。下圖所示為常見的幾種前處理方法。
檢測方法開發(fā)
檢測方法開發(fā)和樣品前處理開發(fā)是緊密相關(guān)的環(huán)節(jié)，這里以LC-MS/MS為例進(jìn)行說明（注：LC-MS/MS是代謝組研究中最為常用的方法），主要分兩個部分：一是色譜方法，二是質(zhì)譜方法。
1.色譜方法開發(fā)
首先需要決定的是色譜柱類型。常用的是C18色譜柱，特定類型的成分，可以選擇其他極性色譜柱如氨基柱、氰基柱、糖柱等，具體可以參照相關(guān)專業(yè)書籍進(jìn)行選擇。
其次需要確定流動相和梯度體系，流動相的選擇和待分析物酸堿性相關(guān)。一般而言，酸類成分，流動相中添加乙酸、甲酸等，可以改善拖尾；堿性成分，主要添加氨水等；對酸堿敏感的目標(biāo)物，一般在流動相中添加緩沖鹽。梯度的選擇也根據(jù)目標(biāo)物性質(zhì)進(jìn)行開發(fā)。
文獻(xiàn)資料中的方法不能完全照搬，在實際開發(fā)的過程中需要進(jìn)行優(yōu)化，因為色譜柱品牌不同、儀器性能不同，流出曲線是有差異的，需要根據(jù)實驗情況選擇最為合理的方案，保證待測目標(biāo)成分和干擾物相互分離，保證較好的響應(yīng)，以及調(diào)整流動相比例優(yōu)化最佳的出峰時間。
需要特別注意的是，HPLC方法中的流動相并不是都能直接轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜端，難揮發(fā)或不能揮發(fā)的緩沖鹽進(jìn)入質(zhì)譜后，容易在離子源處形成結(jié)晶體，甚至損壞質(zhì)譜硬件。如果采用UPLC方法代替HPLC方法，色譜柱、流動相、流速、進(jìn)樣量都應(yīng)該相應(yīng)調(diào)整。
2.質(zhì)譜方法開發(fā)
質(zhì)譜開發(fā)多針對的是三重四級桿質(zhì)譜，這里涉及到母離子Q1的確認(rèn)和碎片離子Q3等信息，所以一般而言，質(zhì)譜方法開發(fā)的第一步是建立標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜方法，通常可通過針泵進(jìn)樣的方式確定離子對信息和檢測參數(shù)。
例如分析樣品中維拉帕米，在文獻(xiàn)查閱環(huán)節(jié)，已明確目標(biāo)物的分子式、結(jié)構(gòu)式、溶解性。見下圖
（圖片來自 AB SCIEX）
通過針泵直接進(jìn)樣（大致1ppm濃度），在Q1環(huán)節(jié)，確定找到標(biāo)準(zhǔn)品的母離子。這里要特別注意的是，母離子有很多加合形式，如M+H、M-Cl、M-Na等，所以在判斷母離子時，不能僅依照物質(zhì)的摩爾分子量，還需要考慮目標(biāo)物的電離特性。在對母離子響應(yīng)不確定的時候，可以增加梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，觀察峰面積是否等比例增加。
找到母離子后，需通過調(diào)節(jié)碰撞能CE，確定碎片離子，即子離子。為了提高子離子的響應(yīng)，需進(jìn)一步對碰撞能CE和去簇電壓DP等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。碰撞能CE不同，碎片的相對豐度不同，根據(jù)最大響應(yīng)值，選擇最佳的碰撞能。去簇電壓DP是為了消除溶劑離子簇，DP越大，去簇效果越好，DP太大會造成離子源內(nèi)裂解。
質(zhì)譜參數(shù)的選擇還有很多，可以根據(jù)實際情況調(diào)整，不同的儀器有不同的最佳參數(shù)，主要目的是保證待分析物有最佳的響應(yīng)值。離子對的選擇一般至少2組，一組作為定量離子，一組作為定性離子。
標(biāo)準(zhǔn)品開發(fā)環(huán)節(jié)，還涉及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的確定，一般而言，最好的內(nèi)標(biāo)物是同位素內(nèi)標(biāo)，與標(biāo)準(zhǔn)品有相同的色譜行為，相同的基質(zhì)效應(yīng)，可以更為準(zhǔn)確的實現(xiàn)目標(biāo)物的絕對定量。
標(biāo)準(zhǔn)品開發(fā)完成后，可以進(jìn)行實際樣品的預(yù)實驗，確定樣品中目標(biāo)物的大致范圍，優(yōu)化色譜梯度比例，根據(jù)響應(yīng)值調(diào)整進(jìn)樣量、進(jìn)樣濃度等信息，同時觀察是否有基質(zhì)干擾，是否需要進(jìn)一步純化等等。
方法學(xué)驗證（僅針對絕對定量方法）
任何方法的開發(fā)和應(yīng)用，都需要一個評價標(biāo)準(zhǔn)，或是一個指導(dǎo)原則，來確定方法的可行性和準(zhǔn)確性。質(zhì)譜分析多涉及生物樣品，藥典附錄中《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》便是一個重要方法學(xué)驗證參照。這里面定義了方法學(xué)考察的要求，也規(guī)定了質(zhì)控指標(biāo)。
要提交完整的開發(fā)方案，方法學(xué)驗證中至少應(yīng)該涉及：標(biāo)準(zhǔn)曲線（線性關(guān)系）、檢出限和定量限、回收率、日內(nèi)日間精密度等。
標(biāo)準(zhǔn)曲線需要盡量涵蓋待測樣品的含量區(qū)間，一般覆蓋三個數(shù)量級，并滿足相關(guān)系數(shù)在合理的范圍，如下圖。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的同時，也需要給出定量限和檢出限指標(biāo)，定量限（LOQ）以10倍噪音為基準(zhǔn)。
回收率主要是考察方法的可靠性，一般達(dá)到80%-120%之間為宜，由于生物樣品的復(fù)雜性，存在復(fù)雜基質(zhì)干擾的情況下，待分析物質(zhì)含量極低的情況下，回收率范圍可以適當(dāng)放寬。
日內(nèi)日間精密度，為均勻樣品多次重復(fù)測定所得結(jié)果的一致性，在一天之內(nèi)進(jìn)行的精密度考察稱為日內(nèi)精密度；在三天之內(nèi)進(jìn)行的精密度考察稱為日間精密度。
總結(jié)
以上是靶向代謝組方法開發(fā)的一個基本流程。實際的開發(fā)中往往更復(fù)雜，可能還涉及質(zhì)控指標(biāo)的建立，數(shù)學(xué)建模分析，報告輸出等等。
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