蛋白表達水平和信號通路的異常是腫瘤最常見的特征，近些年來的研究表明，相比于僅通過基因組分析，蛋白組和修飾組包含了更多的基因無法識別的新信息，這一觀察引出了蛋白基因組學(xué)的概念，綜合多組學(xué)數(shù)據(jù)的分析能夠更全面的認識腫瘤，也為腫瘤未來的精準(zhǔn)治療提供新的思路和方向。
2019年10月31日，Cell在線發(fā)表了題為：Integrated Proteogenomic Characterization of Clear Cell Renal Cell Carcinoma的最新研究成果，來自西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院的王培、約翰霍普金斯大學(xué)的Hui Zhang和Daniel W. Chan（他們的研究重點是蛋白組學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)在診斷、管理以及癌癥了解方面的開發(fā)及應(yīng)用）、密歇根大學(xué)的Marcin Cieslik和Alexey I. Nesvizhskii 并聯(lián)合臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析協(xié)會（CPTAC），運用系統(tǒng)的蛋白基因組學(xué)方法深度揭示腎透明細胞癌病理特征。
腎細胞癌是世界十大常見的癌癥之一，其中75%為腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）并占據(jù)了腎細胞癌死亡的絕大部分，具有典型的Warburg表型。為了闡明驅(qū)動透明細胞腎細胞癌（ccRCC）的功能模塊失調(diào)，作者對未經(jīng)處理的ccRCC和配對的正常鄰近組織樣本進行了全面的基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)表征?；蚪M分析確定了與基因組不穩(wěn)定性相關(guān)的獨特分子亞組，蛋白質(zhì)組學(xué)的整合識別了受基因組改變影響的細胞機制的蛋白質(zhì)失調(diào)：包括氧化磷酸化相關(guān)的代謝、蛋白質(zhì)翻譯過程和磷酸化信號模塊。為了評估單個腫瘤中的免疫浸潤程度，作者還鑒定了微環(huán)境細胞特征，該特征描繪了四種以獨特的細胞途徑為特征的基于免疫的ccRCC亞型。這項研究報告了ccRCC的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以識別基因組改變的功能影響，并為基于ccRCC病理生物學(xué)的合理治療選擇提供了證據(jù)。
研究速讀
1、腫瘤和正常鄰近組織標(biāo)本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
先通過冷凍粉碎法將每個組織均質(zhì)化并進行分裝，使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了110個未接受過治療的RCC和84個配對匹配的NAT樣品（樣本策略），接著對同一組織樣品同時進行了基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析分別鑒定出總共11355種蛋白質(zhì)和42889種磷酸肽，其中在所有樣品中定量了7150種蛋白質(zhì)和20976種磷酸肽。
為了實現(xiàn)多組學(xué)數(shù)據(jù)集成和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，研究對所有110個腫瘤樣品進行了全基因組測序（WGS）、全外顯子組測序（WES）和總RNA測序（RNA-seq），并且107個腫瘤樣品的DNA甲基化數(shù)據(jù)也被非常完美的獲取（組學(xué)策略）。除了初步的病理學(xué)診斷外，作者還利用了TCGA等提供的可用于RCC的分子信息來進一步驗證腫瘤樣品的組織學(xué)分類。對基因組圖譜進行抽樣評估，發(fā)現(xiàn)了7個ccRCC具有非典型分子畸變的腫瘤，例如在3p上缺乏腫瘤抑制基因的特征性雙等位基因缺失?？傮w而言，檢查了來自103個ccRCC和80個NAT組織樣品的數(shù)據(jù)，以進行全面的蛋白質(zhì)組學(xué)表征。
2、CPTAC ccRCC隊列的基因組全貌
ccRCC的largeWGS分析，揭示了3p染色體的臂級丟失是最常見的事件（93％），其次是5q染色體增益（54％），14q染色體缺失（42％），7號染色體增益（34 ％）和9號染色體丟失（21％）。三種常見RCC亞型的全癌分析和通過腫瘤內(nèi)異質(zhì)性方法研究ccRCC腫瘤倍性的研究表明，高基因組非整倍性與不良預(yù)后之間存在顯著關(guān)聯(lián)，這與作者的研究中鑒定出的基因組不穩(wěn)定的高級別腫瘤的富集相一致。以前的報告確定染色體易位是ccRCC同時發(fā)3p丟失和5q增長的機制，作者的WGS數(shù)據(jù)得出研究隊列中出現(xiàn)的染色體重排的頻率和類型。接著，觀察到61％的ccRCC病例顯示出一個或多個易位事件，主要涉及3p染色體基因座，其中5染色體（20％）、2染色體（11％）和8染色體（7％），還檢測了3號染色體內(nèi)的染色體倒置，導(dǎo)致3q增益和3p丟失同時發(fā)生（圖1B）。在CPTAC隊列中，總共103例ccRCC腫瘤中有102例顯示3p失調(diào)的證據(jù)。PBRM1、BAP1、KDM5C和SETD2的突變率分別為43％、17％、18％和16％（圖1C）。作者進一步檢查了這些基因的突變和甲基化對其各自的mRNA和蛋白質(zhì)水平的影響，總體而言，基因組失活事件會導(dǎo)致mRNA和蛋白質(zhì)表達降低（圖1C）。
圖1、基因組改變及其與mRNA、蛋白和磷酸化蛋白豐度的關(guān)系
3、綜合蛋白質(zhì)組學(xué)分析基因組的改變
基因組變化能夠通過順式作用影響同位點的mRNA和蛋白質(zhì)豐度，通過反式作用影響其他位點。對mRNA、蛋白質(zhì)和磷酸肽的綜合分析，鑒定出對轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和翻譯后水平都有影響的基因組變化，并鑒定出與腫瘤級別相關(guān)、癌與非癌組織間差異表達的基因靶點。例如，與PI3K-mTOR信號相關(guān)的SQSTM1、OSBPL3、GOLPH3出現(xiàn)拷貝數(shù)變異（反式作用）；多能轉(zhuǎn)錄因子YY1（反式作用）發(fā)生突變。對這些基因組變化進行通路分析，3p染色體的丟失與缺氧信號的上調(diào)，細胞周期的調(diào)節(jié)和糖酵解、氧化磷酸化（OXPHOS）的下調(diào)、脂肪酸代謝和TCA周期有關(guān)；5q的增加導(dǎo)致mTORC1和MYC信號的上調(diào)，7p的增加推動蛋白質(zhì)翻譯和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的增加；9p缺失導(dǎo)致腫瘤抑制因子CDKN2A缺失，與翻譯起始、m TOR、MYC信號上調(diào)有關(guān)；14q的缺失涉及潛在的腫瘤抑制因子，14q缺失導(dǎo)致WNT信號表達下調(diào)，MYC信號、N-糖基化修飾、IFN- γ信號上調(diào)。其中75%的CIMP+腫瘤存在14q缺失，CIMP +腫瘤具有相似的反式作用，包括增加的MYC信號傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)翻譯，并具有與OXPHOS增加和粘著斑減少相關(guān)的獨特特征。
圖2、拷貝數(shù)變異(CNV)對蛋白質(zhì)豐度的影響
4、轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組表達的相關(guān)性研究
為了解轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)過程之間的調(diào)控關(guān)系，作者計算了103例ccRCC腫瘤和72例NATs中mRNA 與蛋白的樣本間和樣本內(nèi)相關(guān)性。NATs的中位基因相關(guān)值為0.34，而腫瘤的中位值更高為0.43，這與以往研究結(jié)腸直腸癌和高級別漿液性卵巢癌相似(圖3A), 在ccRCC和NATs中，分別有74%和52%的mRNA 與蛋白具有顯著相關(guān)性， OXPHOS、剪接體和核糖體通路在腫瘤中的相關(guān)性較差。在NATs中，剪接體和核糖體的內(nèi)務(wù)活動呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)模式，代表了維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)節(jié)軸。樣本間的mRNA -蛋白相關(guān)性檢測顯示，腫瘤樣本的中位數(shù)樣本間相關(guān)性(0.44)低于NAT樣本(0.52)，后者的方差更低(圖3B) 。如果將高樣本相關(guān)性與蛋白翻譯增加聯(lián)系起來，不難發(fā)現(xiàn)核糖體和翻譯因子蛋白表達一致增加；有趣的是，腫瘤中不協(xié)調(diào)的核糖體蛋白- mRNA水平發(fā)生了協(xié)同轉(zhuǎn)移。然而，在腫瘤中導(dǎo)致核糖體mRNA和蛋白表達解耦聯(lián)的調(diào)節(jié)機制尚不清楚，這表明在評估作為干預(yù)ccRCC治療靶點的核糖體生物發(fā)生時，蛋白質(zhì)證據(jù)的重要性。
圖3、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組豐度的相關(guān)性
5、ccRCC與NAT相比的蛋白質(zhì)組學(xué)變化
通過主成分分析（PCA）和層次聚類可視化鑒定出的大量蛋白質(zhì)，可以清楚地區(qū)分ccRCC（n = 103）和NAT樣品（n = 80）（圖4A）。總共820種蛋白質(zhì)在組織樣品的組比較中顯示出明顯的差異表達，相對于NATs，在ccRCC腫瘤中有565種蛋白質(zhì)被下調(diào)，而255種蛋白質(zhì)被上調(diào)。富集分析顯示，腫瘤中的免疫反應(yīng)、EMT和多種信號通路（缺氧，糖酵解和mTOR）被上調(diào)，而TCA周期，脂肪酸代謝和OXPHOS被下調(diào)（圖4B）。即使考慮到腫瘤和NAT樣品中的組織異質(zhì)性，仍可以維持選擇的細胞途徑。ccRCC腫瘤的特征在于特殊的基因組改變，已將其分類為代謝疾病,這促使作者鑒定和注釋參與細胞代謝的差異豐富的mRNA轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)（圖4C）。在此分析中，糖酵解途徑中的蛋白質(zhì)及其同源mRNA均被上調(diào)，而與OXPHOS相關(guān)的蛋白質(zhì)則被下調(diào)。先前已經(jīng)觀察到ccRCC中代謝mRNA水平與相應(yīng)的糖酵解和OXPHOS代謝物之間存在非線性相關(guān)性。分析腫瘤和NAT之間mRNA和蛋白質(zhì)水平的差異豐度，發(fā)現(xiàn)OXPHOS mRNA和蛋白質(zhì)表達的顯著解偶聯(lián)與其他細胞途徑不同（圖4C-4D）。總之，這些結(jié)果表明，Warburg效應(yīng)的功能性后果并未在轉(zhuǎn)錄水平上完全被捕獲，這可能會影響基于轉(zhuǎn)錄的代謝特征在ccRCC預(yù)后中的臨床應(yīng)用（Warburg效應(yīng)與表觀遺傳，詳情請戳：Nature重大突破：全新組蛋白乳酸化修飾調(diào)控癌癥和炎癥等疾?。?。
圖4 、ccRCC腫瘤和NAT蛋白的差異表達
6、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析激酶和底物調(diào)控途徑、ccRCC的腫瘤分級
磷酸化影響多個細胞過程，其位點的占據(jù)受到其各自底物上激酶和磷酸酶活性的嚴格控制。作者分析了80個腫瘤/ NAT配對組織之間差異化的磷酸肽豐度，以分層對應(yīng)于不同激酶及其抑制劑的磷酸底物，并確定CDK1和MAPK1（ERK2）是大多數(shù)腫瘤中兩個高度排序的磷酸底物事件（圖5A）。此外，與S期進入/進展（CDK7-MCM2）和G2/M檢查點（WEE1-CDK1）相關(guān)的磷酸化底物在大多數(shù)腫瘤中升高；幾乎所有的腫瘤都上調(diào)EGFR（MAPK的上游受體）的蛋白和磷酸肽表達，而對VEGF受體如FLT和KDR則選擇性表達?？v向分析所有腫瘤樣本中磷酸肽豐度差異，鑒定出幾種磷酸肽共表達網(wǎng)絡(luò)，包括細胞周期和血管生成兩個不依賴于整體蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組變化的模塊。此外，作者的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定了在腫瘤中激活的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并為擴大治療選擇范圍提供了證據(jù)，使其有望超出目前FDA批準(zhǔn)的靶向VEGF和mTOR的療法（圖5B）。
腫瘤分級是ccRCC的重要預(yù)后指標(biāo)，通常和腫瘤階段、腫瘤大小有關(guān)。高級別腫瘤中，參與翻譯、mTOR信號、EMT等通路的基因在mRNA和蛋白水平均上調(diào)，其他細胞通路則在轉(zhuǎn)錄組和蛋白組出現(xiàn)非協(xié)同性上調(diào)，如細胞周期調(diào)控和DNA修復(fù)的mRNA增加，而OXPHOS和N-糖基化修飾的蛋白增加。低級別的腫瘤表現(xiàn)出受體激酶、RAS、MAPK、Notch、RAP1信號通路等在mRNA和蛋白的增加，同時上調(diào)轉(zhuǎn)錄相關(guān)過程的蛋白表達。
ccRCC根據(jù)腫瘤的蛋白組差異被分為3組，ccRCC1：上調(diào)適應(yīng)性免疫、N-糖基化修飾、OXPHOS和脂肪酸代謝相關(guān)蛋白，與高級別和晚期腫瘤有關(guān)。ccRCC2：腫瘤高表達天然免疫和血小板脫顆粒相關(guān)的蛋白。ccRCC3:上調(diào)糖酵解、mTOR信號、低氧相關(guān)的蛋白。ccRCC2和ccRCC3與較低的腫瘤級別相關(guān)，而僅有ccRCC2與腫瘤早期相關(guān)。
圖5、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析與ccRCC腫瘤分級
總的來說，這項研究揭示了獨特的生物學(xué)見解，提出了只有將互補的蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組分析結(jié)合起來，才能將基因組畸變的功能性后果與蛋白質(zhì)組學(xué)成果相關(guān)聯(lián)。對腫瘤和相應(yīng)的NAT進行全面的基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)測量的集成，為深入研究ccRCC腫瘤發(fā)生提供了寶貴的生物信息資源。作者的多層次“組學(xué)”分析可識別在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上尚未完全捕獲的潛在分子機制，并定義蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫標(biāo)記是對ccRCC患者進行分層所必需的，終極目標(biāo)是為了開發(fā)合理的治療性干預(yù)措施。
參考文獻
Clark, D. J., et al., (2019). Integrated Proteogenomic Characterization of Clear Cell Renal Cell Carcinoma.Cell.
轉(zhuǎn)載于Dr.Proteomics 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)與蛋白組學(xué)
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